新疆狗牙根抗寒基因的克隆和功能初步验证

发布时间：2018-08-27 17:28

【摘要】：新疆狗牙根在有雪覆盖的情况下能耐-32℃低温,是一种优良的抗寒狗牙根资源,为探讨其抗寒分子机制,挖掘抗寒基因,本研究在关联分析确定关联位点的基础上,利用BSA法获取狗牙根抗寒相关差异序列,结合电子克隆和RT-PCR方法克隆狗牙根抗寒基因,并对其功能进行初步验证。主要研究结果如下:利用已知抗寒相关位点对狗牙根抗寒和寒敏感基因池进行PCR扩增,获得抗寒相关差异片段,并对其序列进行分析。共获得差异片段43个,26条序列成功测序;经生物信息学分析,17条差异序列具有同源序列,其中14条为代谢酶类及蛋白等,3条差异序列为未知位点;9条序列未找到同源序列,可能是一些新基因;其中差异序列ES8174-2与水稻小分子量低温诱导膜蛋白LTI6A、玉米疏水性蛋白LTI6A和狼尾草低温和盐响应蛋白同源性较高,一致性分别达到94%、90%和93%。以ES8174-2片段为基础,进行电子克隆。根据电子克隆的基因相关序列设计引物,并结合RT-PCR的方法从新农1号狗牙根中克隆到狗牙根LTI6A基因。经分析,该基因与电子克隆序列一致性达到93%;利用生物信息学的方法进行功能预测,表明狗牙根LTI6A基因编码蛋白的分子量为6229.6 Da,理论等电点pI:4.56,原子组成为C306H462N60O70S4,消光系数14105,不稳定系数为40.11,亲水性平均系数为1.509,脂肪系数为141.07;含有两个跨膜结构、无信号肽、为疏水蛋白并且定位于细胞质膜中。狗牙根LTI6A基因编码的蛋白可能与水稻OsLTI6A基因编码的蛋白在细胞内部执行的功能相似。利用基因重组技术构建了表达载体pCAMBIA1301-LTI6A,通过农杆菌介导方法将狗牙根LTI6A基因插入到烟草基因组中。对获得的阳性转基因烟草植株进行低温胁迫处理,与阴性对照相比,转基因烟草植株相对电导率较低;恢复正常温度培养后转基因烟草植株未出现冷冻斑点。说明该基因能够减少电解质外渗提高膜的稳定性,初步表明狗牙根LTI6A基因可以提高植物的抗寒性。
[Abstract]:Xinjiang dogtooth has the ability to withstand -32 鈩，

本文编号：2207945