不同启动子驱动下马铃薯蛋白酶抑制剂PinⅡ转基因水稻的遗传、表达和抗虫性

发布时间：2016-12-23 09:27

  本文关键词：高效抗虫转基因水稻的研究与开发，由笔耕文化传播整理发布。

《南京农业大学》 2006年

不同启动子驱动下马铃薯蛋白酶抑制剂PinⅡ转基因水稻的遗传、表达和抗虫性分析

武亮  

【摘要】：蛋白酶抑制剂是一类广泛存在于植物中的蛋白质。它不仅是植物的储藏蛋白，而且是植物中重要的防御蛋白。马铃薯蛋白酶抑制剂PinⅡ属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，可以同时抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性，因而对害虫产生广谱和稳定抗性。本研究通过农杆菌介导法得到了PinⅡ日本晴转基因水稻，并以不同启动子驱动下马铃薯蛋白酶抑制剂PinⅡ三个品种的转基因水稻为材料，进行了遗传、表达和抗虫性分析，主要研究结果如下： 1、利用农杆菌介导法，将本实验室构建的双元载体pNAR301(ActⅠ5’+PinⅡ-2x+PinⅡ3’)，pNAR302(Ubi5’+PinⅡ-2x+NOS3’)和pNAR303(PinⅡ5’+PinⅡ-4x+PinⅡ3’)导入水稻品种日本晴中，共得到12株独立的转基因苗，经离体叶片潮霉素抗性筛选和PCR鉴定，共有8株呈阳性，阳性率为67.7％。 2、经潮霉素抗性筛选、PCR和Southern blot等检测对转基因水稻后代进行了遗传分析。潮霉素磷酸转移酶基因hpt在68.4％的转基因植株中符合孟德尔遗传模式；具有潮霉素抗性的植株在PCR中均能扩增出目的条带；Southern blot检测显示：外源基因大部分以单拷贝插入植物基因组，单拷贝植株率为63.6％，且没有出现基因重排现象。由此证明，马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因已经稳定整合入水稻基因组。 3、利用Northern blot分析和酶活性测定的方式，分别在RNA水平和蛋白水平检测目的基因在转基因植株中的表达。PinⅡ在不同植株中的转录不同，且与其在转基因植株基因组中的拷贝数无关；蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶活性的抑制程度与基因的启动子强度有关，ActⅠ和Ubi驱动的PinⅡ-2x转基因水稻植株中，每克鲜叶片的PinⅡ蛋白含量为160μg和17μg，而由PIN5’驱动的PinⅡ-4x为104μg，对照水稻仅为20μg。ActⅠ和Ubi驱动的PinⅡ达产物对胰蛋白酶活性抑制程度分别达到37.7％和43.1％，明显高于PinⅡ自身启动子PinⅡ5’(29.2％)。

【关键词】：
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：S511
【目录】：

中文摘要6-8

英文摘要8-10

第一章 文献综述10-24

第一节 水稻抗虫基因工程研究进展10-16

1.微生物来源的抗虫基因10-12

2.植物来源的抗虫基因12-15

3.动物来源的抗虫基因15

4.抗虫基因工程遇到的问题和应对措施15

5.转基因水稻的生态安全性和生态风险评价15-16

第二节 植物蛋白酶抑制剂在抗虫基因工程中的作用16-23

1.丝氨酸蛋白酶抑制剂17-20

2.半胱氨酸蛋白酶抑制剂20-21

3.精氨酸蛋白酶抑制剂21

4.金属蛋白酶抑制剂21

5.蛋白酶抑制剂在抗虫基因工程中存在的问题和策略21-23

第三节 本研究的目的和意义23-24

第二章 马铃薯蛋白酶抑制剂转基因水稻植株的获得24-37

1.材料和方法25-31

2.结果与分析31-35

3.讨论35-37

第三章 PinⅡ和hpt基因在转基因水稻中的遗传37-47

1.材料和方法38-42

2.结果与分析42-46

3.讨论46-47

第四章 PinⅡ在转基因水稻中的表达分析47-55

1.材料和方法48-51

2.结果与分析51-54

3.讨论54-55

第五章 PinⅡ转基因水稻的抗虫性分析55-66

1.材料和方法56-58

2.结果与分析58-64

3.讨论64-66

全文结论66-67

参考文献67-74

附录174-76

攻读硕士期间发表的文章76-77

致谢77

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【参考文献】

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  本文关键词：高效抗虫转基因水稻的研究与开发，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：224503