下调Dicer1基因激活自噬促进卵巢癌细胞株C13K对顺铂耐药的研究

发布时间：2018-10-18 08:48

【摘要】：【目的】核糖核酸酶III核酸内切酶Dicer1是Micro RNA合成的关键酶之一,主要位于细胞胞质中。在卵巢肿瘤的研究中,卵巢癌患者伴有Dicer1基因的异常调节往往提示预后不良。但是至今有关Dicer1基因如何影响卵巢癌的生物学特性和化疗耐药的研究并不是很清楚。因此本实验的研究主要目的是在卵巢癌细胞株C13K中,下调Dicer1基因可以诱导自噬参与卵巢癌的化疗耐药的探索。【方法】本实验主要的实验方法是:(1)运用细胞增殖与毒性实验(CCK8)来检测下调Dicer1基因后卵巢癌细胞株C13K顺铂的敏感性及半数抑制浓度(IC50)。(2)利用小干扰RNA(si RNA)技术进行下调卵巢癌细胞株C13K中的Dicer1基的表达量和下调Dicer1基因后对顺铂的敏感性以及加入抑制自噬的药物(3-MA)后是否逆转这种耐药效应,其次通过蛋白质印记(western blot)观察Dicer1和自噬相关的关键基因(ATG5,LC3B)在下调Dicer1基因后卵巢癌细胞株C13K的表达量以及下调Dicer1基因并且顺铂处理后凋亡蛋白(Caspase3,c-PARP)的表达量。(3)通过透射电子显微镜及共聚焦激光扫描显微镜技术,来观察Dicer1基因下调以及顺铂处理后卵巢癌细胞的自噬体的变化。(4)通过流式细胞学实验技术,来观察Dicer1-si,ATG5-si以及顺铂处理后细胞凋亡的情况。(5)通过运用公共数据库TCGA,我们研究了Dicer1基因和ATG5基因在卵巢癌病人中的表达与预后的关系。【结果】根据以上实验数据及现象,可以得到如下结果:(1)通过CCK8发现卵巢癌细胞株C13K在Dicer1基因下调后对化疗药物顺铂的耐药性增加。(2)通过si RNA干扰和western blot发现下调Dicer1基因在卵巢癌细胞株(C13K)的表达后,凋亡蛋白(Caspase3,c-PARP)表达也降低且加入自噬抑制剂(3MA)可以逆转这种耐药效应。(3)通过透射电子显微镜和荧光共聚焦激光扫描显微镜发现Dicer1下调后以及顺铂处理后,自噬现象比较明显。(4)在TCGA数据库中,发现Dicer1基因表达量低的患者预后较差,自噬基因(ATG5)表达量高的患者预后不良。(5)我们把自噬形成的关键基因(ATG5)沉默以及使用药物抑制自噬生成后,发现C13K对顺铂的敏感性增加。【结论】通过以上实验数据的结果分析,我们可以得出一个这样的结论即在卵巢癌细胞株C13K中,Dicer1下调可以诱导自噬的发生进而促进卵巢癌细胞对化疗药物顺铂的耐药,也许可以为我们以后的临床实践提供一种新的治疗策略。
[Abstract]:[objective] ribonuclease III endonuclease Dicer1 is one of the key enzymes in the synthesis of Micro RNA, mainly in the cytoplasm of cells. In the study of ovarian neoplasms, ovarian cancer patients with abnormal regulation of Dicer1 gene often suggest poor prognosis. However, it is not clear how the Dicer1 gene affects the biological characteristics and chemotherapeutic resistance of ovarian cancer. Therefore, the main purpose of this study was to study in ovarian cancer cell line C13K, Down-regulation of Dicer1 gene can induce autophagy to participate in chemotherapeutic resistance of ovarian cancer. [methods] the main experimental methods in this experiment are as follows: (1) the cell proliferation and toxicity test (CCK8) was used to detect the C13K cis-sequence of ovarian cancer cell line after down-regulation of Dicer1 gene. Platinum sensitivity and half inhibitory concentration (IC50). (_ 2) using small interfering RNA (si RNA) technique to down-regulate the expression of Dicer1 in ovarian cancer cell line C13K and the sensitivity of Dicer1 gene to cisplatin and whether to add an anti-autophagy drug (3-MA) Reversing the drug resistance effect, Secondly, the expression of Dicer1 and autophagy related key gene (ATG5,LC3B) in ovarian cancer cell line C13K after down-regulation of Dicer1 gene and the expression of apoptotic protein (Caspase3,c-PARP) after down-regulation of Dicer1 gene and cisplatin treatment were observed by protein imprinted (western blot). (3) the expression of apoptotic protein (Caspase3,c-PARP) in ovarian cancer cell line after down-regulation of Dicer1 gene. Electron microscopy and confocal laser scanning microscopy, To observe the Dicer1 gene down-regulation and cisplatin treatment of ovarian cancer cells autophagy changes. (4) flow cytology, (5) by using common database TCGA, we studied the relationship between the expression of Dicer1 gene and ATG5 gene and prognosis in patients with ovarian cancer. [results] based on the above experimental data and phenomena, we studied the relationship between the expression of Dicer1 gene and ATG5 gene in patients with ovarian cancer. The results were as follows: (1) the chemotherapeutic drug resistance of ovarian cancer cell line C13K was increased after the down-regulation of Dicer1 gene by CCK8. (2) the expression of Dicer1 gene in ovarian cancer cell line (C13K) was down-regulated by si RNA interference and western blot. The expression of apoptotic protein (Caspase3,c-PARP) was also decreased and the drug resistance was reversed by the addition of autophagy inhibitor (3MA). (3) the down-regulation of Dicer1 and cisplatin treatment were observed by transmission electron microscopy and fluorescence confocal laser scanning microscope. Autophagy was more obvious. (4) in TCGA database, patients with low Dicer1 gene expression had poor prognosis. The prognosis of patients with high expression of autophagy gene (ATG5) was poor. (5) after silencing autophagy key gene (ATG5) and inhibiting autophagy with drugs, we found that C13K was more sensitive to cisplatin. [conclusion] based on the results of the above experimental data, we found that C13K was more sensitive to cisplatin. We can conclude that in ovarian cancer cell line C13K, down-regulation of Dicer1 induces autophagy and promotes the chemotherapeutic drug resistance of ovarian cancer cells to cisplatin. It may provide a new treatment strategy for our future clinical practice.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31

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本文编号：2278611