p38MAPK基因沉默对唇裂术后瘢痕增生影响的实验研究

发布时间：2018-10-31 11:05

【摘要】：目的通过建立模拟人唇裂术后伤口愈合的兔上唇瘢痕模型,对此模型进行术后瘢痕生长的时间序列研究以明确兔上唇唇裂术后瘢痕增生最严重程度所在时间。通过构建p38MAPK基因沉默重组腺病毒干扰靶基因的表达,检测不同时间点p38MAPK信号通路受阻后对兔模型上唇瘢痕的影响效果来寻找基因治疗瘢痕的最佳时间以及探讨Smad信号通路与p38MAPK之间的cross-talk(交叉对话)情况。从整体水平阐明腺病毒介导的p38MAPK基因沉默对兔上唇瘢痕模型的治疗性作用的分子机制。为开拓对我国唇裂术后瘢痕增生高危人群的早期防治的新途径奠定基础。方法1.运用Millard's单侧唇裂修复法完成兔上唇瘢痕模型的构建。2.分别在术后2、3、4、5周测量瘢痕体积并进行肌成纤维细胞(MFB)的细胞计数,随后通过免疫组织化学染色和Western blot定性和定量检测兔上唇瘢痕组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的含量。3.筛选p38MAPK基因沉默最有效shRNA序列及构建腺病毒载体。4.术后0周、1周、2周分别进行瘢痕组织p38MAPK基因沉默腺病毒转染,然后在术后3周获取标本,用四种方法(天狼猩红染色、免疫组织化学染色、Western blot、Real-time PCR)分别定性、定量检测p38MAPK及瘢痕形成相关因子(colⅠ、colIII、MMP1、TIMP1)的蛋白和mRNA的相对表达水平。5.Y 周时,用 Western blot 和 Real-time PCR 检测 Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、p38MAPK及p-p38MAPK的mRNA和蛋白的相对表达水平。结果1.成功构建兔上唇唇裂术后瘢痕模型。2.瘢痕体积和MFB细胞计数结果显示,术后2周与术后5周,术后3周与术后4周无统计学意义(P0.05),术后2周与术后3周及4周均有明显统计学差异(P0.01)。免疫组化染色结果显示:术后3周、4周瘢痕组织中α-SMA表达明显多于术后2周、5周。Western blot结果显示:术后3周、4周瘢痕组织中α-SMA蛋白表达较术后2周、5周增强,结果具有统计学意义(P0.05)。3.成功筛选出p38MAPK基因沉默最有效shRNA序列并构建了腺病毒载体。4.局部注射腺病毒后,天狼猩红染色结果示:术后1周瘢痕组织中colIII表达明显多于术后0周及2周,术后1周瘢痕组织中colⅠ表达明显少于术后0周及2周。免疫组化染色结果显示:术后1周瘢痕组织中colIII、MMP1表达明显多于术后0周及2周,术后1周瘢痕组织中colⅠ、TIMP1表达明显少于术后0周及2周。Western blot结果显示:术后1周瘢痕组织中colIII及MMP1蛋白较术后0周及2周表达增强,术后1周瘢痕组织中p38MAPK、colⅠ及TIMP1蛋白较术后0周及2周表达减弱。Real-time PCR结果示:术后1周瘢痕组织中colⅢ及MMP1的mRNA水平较术后0周及2周升高,术后1周瘢痕组织中p38MAPK、colⅠ及TIMP1的mRNA水平较术后0周及2周降低。5.术后1周注射腺病毒,Western blot结果显示:与对照组相比,术后1周瘢痕组织中p-Smad2、p-Smad3及p-p38MAPK蛋白表达降低。Real-time PCR结果示:术后1周瘢痕组织中Smad2、Smad3及p38MAPK的mRNA水平较对照组降低。结论为研究基因治疗唇裂术后瘢痕增生提供了兔上唇瘢痕模型,通过实验可得术后3周及4周时瘢痕增生达最严重程度。在此之前1周局部注射腺病毒,靶基因沉默效果最佳,治疗效果最好,并研究了 Smad与p38MAPK之间的cross-talk情况。从整体水平阐明腺病毒介导的p38MAPK基因沉默对兔模型上唇瘢痕的治疗性作用的分子机制。为开拓对我国唇裂术后瘢痕增生高危人群的早期防治的新途径奠定基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R782.2

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本文编号：2301953