同种异基因脂肪来源间充质干细胞辅助自体脂肪移植的实验研究

发布时间：2018-10-31 12:24

【摘要】：【研究背景】脂肪移植技术因脂肪组织来源丰富,获取方便,操作相对简单、微创,故在美容和修复重建领域得到越来越广泛的应用。然而,术后移植的脂肪容易出现脂肪结节、囊泡等并发症,更因术后低且不稳定的脂肪容积保有率(20 80%)严重制约了该技术进一步发展。2001年Zuk等学者第一次从人的脂肪组织中分离出具有多向分化能力的干细胞,命名为脂肪来源间充质干细胞(ADSCS)。ADSCS具有转分化为血管内皮细胞和脂肪细胞的能力,具有抗组织细胞凋亡和促进移植物血管化的作用,因此利用ADSCS辅助自体脂肪移植能明显降低脂肪结节、囊泡等并发症的发生几率,降低脂肪吸收率,进而提高移植脂肪成活质量和长期容积保有率。然而,消瘦的患者缺乏可以获得充足ADSCS的脂肪组织;ADSCS的分化与再生能力随年龄的增加而减弱,故难以从老年患者体内获得高活力的ADSCS;糖尿病、红斑狼疮等自身免疫相关性疾病改变了该类患者ADSCS的细胞属性,使其自身的ADSCS丧失了细胞保护和再生的功能。基于以上原因,传统的ADSCS辅助脂肪移植术在消瘦的、老龄的、自身免疫相关性疾病的患者中无法有效展开。鉴于ADSCS具有低免疫性和免疫抑制能力,利用同种异基因充足、健康的ADSCS辅助自体脂肪移植可能是解决上述问题有效的方法。【研究目的】1、通过对Lewis和BN大鼠腹股沟皮下脂肪和附睾周围脂肪组织的ADSCS获取、培养、鉴定,探讨哪个部位来源的ADSCS具有更高的生物活性。2、通过建立刀豆蛋白刺激脾单个核细胞(MNCs)增殖的模型,探究不同浓度的ADSCS对于MNCs增殖的影响;探讨同基因和异基因ADSCS的低免疫原性和免疫抑制能力。3、建立BN大鼠来源的ADSCS辅助Lewis大鼠脂肪移植的动物模型,观察同种异基因ADSCS是否降低了自体脂肪移植过程中的细胞损伤程度;是否促进移植脂肪的再血管化过程;是否提高了移植脂肪的长期容积保有率。并检测了移植的同种异基因ADSCS和宿主间可能发生的免疫反应。【研究方法】1、Lewis和BN大鼠的腹股沟皮下脂肪和附睾周围脂肪通过酶消化法来分离和培养ADSCS,通过表面分子检测和诱导分化鉴定其是否为ADSCS;并且测定两种部位来源细胞的形态学、生长曲线、细胞周期。2、利用流式细胞分析仪检测与免疫原性相关的细胞表面分子CD40、CD80、CD86、MHC-I、MHC-II;建立ADSCS与活化的MNCs共培养的细胞模型,检测在此共培养体系中同基因和异基因ADSCS对脾单个核细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、以及CD4/CD25/Foxp3 Treg细胞比例的影响。3、建立BN大鼠来源的ADSCS辅助Lewis大鼠自体脂肪移植的动物模型。在脂肪移植术后7天和14天,检测了HE组织染色、脂周蛋白、原位细胞凋亡等反映脂肪组织细胞损伤指标;进行了VEGF的ELAISA和CD34的免疫组织化学等反映移植组织血管化指标的检测;进行了外周血CD4/CD8和CD4/CD25/Foxp3等反映免疫反应指标的检测。【结果】1、Lewis和BN大鼠获取的ADSCS,无种属上的明显区别;但与腹股沟皮下脂肪相比,两种大鼠附睾周围脂肪组织的纤维组织更少,在进行剪碎脂肪操作时更加省时省力;附睾脂肪组织纯度更高,单位质量获取的ADSCS的数量更多;而且附睾来源的ADSCS具有更早的贴壁时间,更佳的增殖能力和更短的传代时间;综上所述,附睾脂肪组织来源的ADSCS更加适合作为实验细胞。2、流式细胞仪检测发现,ADSCS不表达CD40、CD80、CD84、MHC-II和中度表达MHC-I。在ADSCS与活化的MNCs共培养的细胞模型中,ADSCS明显降低了MNCs的增殖,增加了处于G0/G1期的MNCs细胞比例;抑制了MNCs的凋亡;提高了具有负向免疫调节能力的CD4/CD25/Foxp3 Treg细胞的比例。3、在建立BN大鼠来源的ADSCS辅助Lewis大鼠脂肪移植的模型中,发现异基因和同基因ADSCS均能减轻移植术后7天、14天的脂肪细胞损伤与凋亡;增加移植物血管密度和血管内皮生长因子的含量;提高术后3月时脂肪容积保有率。移植术后7天、14天的宿主外周血中CD4/CD8比值和CD4/CD25/Foxp3 Treg含量在异基因干细胞组和对照组之间并无统计学差异。【结论】1、与腹股沟皮下脂肪相比,Lewis和BN大鼠附睾周围脂肪来源的ADSCS获取效率更高和增殖传代能力更强。2、ADSCS具有低免疫原性和免疫抑制性。同基因和异基因ADSCS均能降低Lewis大鼠的已经活化的MNCs增殖、抑制MNCs的细胞分裂、提高MNCs中CD4/CD25/Foxp3+Treg细胞的含量。但是并不促进MNCs凋亡的发生。3、在建立BN大鼠来源的ADSCS辅助Lewis大鼠脂肪移植的动物模型中,异基因ADSCS和同基因ADSCS一样能够降低术后7天、14天的细胞损伤和凋亡;促进移植物的血管化进程;提高移植脂肪组织的长期容积保有率;而且未发现异基因ADSCS引起的免疫排斥反应。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R622

【参考文献】