菊花CmMET1基因RNAi载体的构建及对菊花和青蒿的遗传转化

发布时间：2018-11-03 10:04

【摘要】：随着社会的发展,人们越来越重视观赏植物的经济、人文和社会价值,因此对观赏植物的育种要求也越来越高。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰现象对菊花(Dendranthema×grandiflora)基因沉默和基因组稳定性至关重要。为追求更多新颖奇特的育种目标,提出了利用RNAi技术调控菊花DNA甲基转移酶基因的表达,通过青蒿(Artemisia annua L.)嫁接传递RNAi信号,进而改变菊花基因组DNA甲基化水平,从而诱导其发生性状变异的育种新思路。本研究从甲基转移酶CmMET1基因着手,通过RNAi调控该基因的表达,促使菊花基因组DNA甲基化水平降低,进而创造新的变异类型,主要研究结果如下:(1)菊花CmMET1基因部分核苷酸序列的多样性分析通过DNAMAN软件比对分析菊花“紫精灵”和青蒿MET1基因的cDNA全长核苷酸序列,选取4段核苷酸序列设计引物对9个菊花品种进行靶序列的扩增,序列比对分析得出:只有引物Chry2扩增的核苷酸序列在菊花品种之间同源性较低,相似率最高只达到63.74%,且这段序列也是菊花和青蒿之间的非同源序列;其他三对引物扩增得到的核苷酸片段在菊花各品种中差异不明显,有些品种间甚至没有差异,相似率的比例范围在97.43%-100.0%。(2)构建RNAi载体选取不同菊花品种间的两段保守序列,分别位于菊花CmMET1基因第2417到第2515个碱基以及第1601到第1767个碱基之间,在其两侧位置设计引物,扩增片段长度分别是136 bp和184 bp。利用“酶切-连接”法成功将目的片段正反向连入RNAi空载体(DHpart27RNAiFADP1P4),并转入农杆菌GV3101。(3)建立菊花“紫精灵”和“国庆红”茎段愈伤组织诱导和再生体系(1)“紫精灵”茎段最优愈伤组织诱导和分化培养基:MS+3%蔗糖+0.7%琼脂粉+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D,诱导率为76.7%;MS+3%蔗糖+0.7%琼脂粉+1.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA,分化率为75.3%;(2)“国庆红”茎段最优愈伤组织诱导和分化培养基:MS+3%蔗糖+0.7%琼脂粉+2.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2,4-D,诱导率为63%;MS+3%蔗糖+0.7%琼脂粉+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA,分化率为63.8%;(3)二者最优生根培养基:MS+3%蔗糖+0.7%琼脂粉,生根率均达到100%。(4)RNAi载体转入菊花将含不同目标序列的RNAi载体转入菊花“紫精灵”和“国庆红”的愈伤组织。最终在农杆菌菌液OD600为0.4-0.5,卡纳霉素浓度为10 mg/L的转化条件下分别获得“紫精灵”和“国庆红”的转化植株16株和14株,很多转化植株出现生长缓慢,矮化,叶柄变长,叶片变少,叶片白化和死亡等现象。分别选取生长健壮的“紫精灵”和“国庆红”的转化植株8株和6株进行卡纳标记筛选,得到6株和5株阳性转化植株。再各选取2株阳性转化植株进行甲基转移酶CmMET1基因的表达量检测,结果分析得出,“紫精灵”和“国庆红”的阳性转化植株甲基转移酶CmMET1基因表达量分别为对照的54%、52.5%和53%、54.5%。(5)RNAi载体转入青蒿青蒿愈伤组织在农杆菌菌液OD600为0.5-0.6,卡纳霉素浓度为8 mg/L的转化条件下获得8株转化植株。与青蒿MET1基因序列同源性较高的RNAi载体的转化植株出现叶柄变长,叶片变少,叶片缺刻变少变浅和死亡等现象。而与青蒿MET1基因同源性较低的RNAi载体转化植株仅表现为矮化,生长缓慢,在8株转化植株中选取健壮的5棵进行卡纳霉素标记筛选获得3株阳性转化植株。再选取2株阳性转化植株检测甲基转移酶MET1基因的表达量,发现表达量分别为对照的90.5%、95.5%。
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【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S682.11

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