田菁根瘤菌ROS相关基因katG和oxyR在抗氧化及共生固氮过程中的功能研究

发布时间：2018-11-08 10:13

【摘要】：活性氧(reactive oxygen species,ROS)存在于生物体的活细胞内,是由氧分子(O2)的不完全还原产生,包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(HO)和过氧化氢(H202)。ROS在细胞中会损伤脂类、蛋白和核苷酸。如在豆科植物与根瘤菌共生形成瘤体的过程中,豆科植物会产生ROS作为一种防御机制,此时根瘤菌会遭受到ROS的威胁。然而,这些ROS信号又能够促进结瘤因子的产生而且对瘤体的发育和固氮酶活性具有积极的作用。因此,根瘤菌如何应对宿主产生的ROS是成功完成共生固氮的一个关键问题。已有研究发现,过氧化氢酶(catalase)是清除无机过氧化物最主要的一类酶。田菁根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)与毛萼田菁(Sesbania rostrata)形成的茎瘤,与根瘤相比,虽然面对更大的氧胁迫,但其固氮效率却比根瘤高得多,因此研究田菁根瘤菌在共生固氮过程中如何应对ROS是一个非常好的模型。通过生物信息学方法确定了田菁根瘤菌catalase相关基因katG(azc_3290)及其调控基因oxyR(azc_4162)。然后对katG和otyR基因进行了框内敲除。在体外条件下,测定WT、ΔkatG和ΔoxyR的生长曲线,结果发现katG和oxyR基因的敲除并不影响菌体的正常生长。为了检测katG和oxyR基因的敲除对于其抗H202的影响,我们进行了抑菌圈实验和杀菌实验。结果发现,与WT相比,ΔkatG对H2O2十分敏感,ΔoxyR对H202有一定的敏感性,没有ΔkatG显著,原因可能是OxyR是一个调控蛋白。为了进一步验证上述结果,对这两个基因进行了回复突变实验,结果发现两者在抗氧化能力方面都有部分回复。以上实验证明了katG和oxyR基因在田菁根瘤菌抗ROS方面发挥重要的作用。据报道,在许多其他细菌中都存在OxyR对catalase的调控作用,如大肠杆菌。因此,我们也研究了田菁根瘤菌中OxyR对katG的调控作用,通过构建katG中间片段转录融合表达体系,在这个体系中报告基因lacZ是直接插入到田菁根瘤菌染色体的katG基因的中间位置,如此katG基因也被破坏。在WT和ΔoxyR菌株中检测katG的表达量,结果发现在ΔoxyR中katG的表达量大幅度下降,而H202对于katG的表达没有影响,这说明katG受OxyR正调控,但不受H2O2诱导。对数期和稳定期都进行了同样的实验,得到的结论基本一致。而且ΔoxyR回复突变株在katG的表达上具有部分回复作用。为了进一步研究katG和oxyR基因在共生固氮过程中的作用。我们进行了结瘤实验和固氮酶活性测定实验,对WT、ΔkatG和ΔotyR的结瘤能力和固氮酶活性进行了测定。结果发现katG和oxyR基因的缺失会使田菁根瘤菌形成茎瘤的数量降低了 50%,同时固氮酶活性较WT相比降低了 60%。这说明katG和oxyR基因在共生固氮过程中具有十分重要的作用。由于katG和oxyR基因的缺失会影响其结瘤和固氮,因此对田菁根瘤菌中结瘤和固氮的关键基因nodA和nifA的表达情况进行了研究。我们构建了nodA和nifA翻译融合质粒,在WT、ΔkatG和ΔoxyR菌株中检测nodA和nifA表达。已知nodA基因的表达能够被柚皮素诱导,在有或无柚皮素、有或无H2O2的条件下检测,发现nodA在WT、ΔkatG和ΔoxyR中的表达基本没有太大差异,而H202对于nodA的表达也没有太大影响;对于nifA来说,其在无氮培养基中会被诱导表达,在有或无氮培养基、有或无H202的条件下检测,发现其在WT、ΔkatG和ΔoxyR中的表达也基本没有太大差异,而H2O2对其表达没有影响。总之,在本实验条件下katG和oxyR的敲除基本不影响nodA和nifA的表达。通过研究发现,catalase相关基因katG在田菁根瘤菌共生固氮过程中发挥重要的作用,它的缺失直接影响到结瘤和固氮能力,并且在体外条件下受OxyR蛋白正调控,对于抵抗H202发挥着重要的作用。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q939.114

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

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本文编号：2318164