【摘要】：为解决聚乙烯塑料在环境中难降解的问题,本研究筛选出一株菌用于聚乙烯塑料生物降解研究。经筛选纯化,对该菌进行生理生化实验和16Sr DNA序列分析;将菌株先后接种于以不同分子量聚乙烯(PE)粉末(Mw=2000、5000、100000)和膜片(Mw100000)为唯一碳源的基础液体培养基中,28℃,180rpm培养;每24小时,用分光光度法测定菌体生长浓度和胞外蛋白含量;培养60天后,称取残留PE重量,用扫描电子显微镜观察膜片表观,用拉力测试机、水接触角测定仪以及红外光谱仪测定膜片性能。为进一步提高原始菌株对高分子量PE的降解能力,本研究对原始菌株进行了诱变处理。采用紫外辐照、微波热效应、Li Cl、盐酸羟胺、吖啶橙以及紫外+吖啶的方法对菌株进行诱变;用分子量2000、5000、100000再到膜片的PE分子量梯度筛选法,对诱变菌株进行筛选;通过诱变菌株在以聚乙烯为唯一碳源的培养基中的菌体生长情况、胞外蛋白含量、以及膜片失重率等指标,选出降解性能最优的菌株,再将该菌株与原始菌株在相同培养条件下(以PE膜片为唯一碳源)培养60天,测定膜片力学性能。为找出降解PE的关键基因和代谢通路,我们将原始菌株在不同碳源培养条件下的(G组:以可溶性淀粉为唯一碳源;W组:以PE为唯一碳源)基因表达情况进行转录组测序分析,经RNA提取纯化、建库、测序、质控等过程,再进行GO、COG、KEGG数据库注释比对、聚类和富集分析;对两个处理组的基因表达量进行差异比较;最后随机选取差异基因进行RT-PCR表达量验证。结果表明,筛选出的菌株为放线菌属的东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis),命名为ZEL-1。该菌在分子量越低的聚乙烯培养液中,菌浓度、胞外蛋白含量、还原糖含量、聚乙烯失重率越高,菌液p H值下降得越快;电镜观察发现膜片表面有大量降解孔洞;膜片拉伸强度降低74.15%,断裂伸长率减少84.90%,力学性能显著下降;水接触角从78.58±0.10°变小到41.25±0.16°,亲水性增大;红外光谱研究结果表明,膜片在菌株的降解作用下先后生成酮羰基和酯羰基。诱变育种结果表明,紫外辐照50s,微波诱变800Hz、120s,0.02%吖啶橙,0.7%Li Cl,0.6%盐酸羟胺,为各方法的最优的诱变剂量。复合诱变采用紫外50s的突变菌株为出发菌株,再用0.02%吖啶橙诱变。PE培养基中菌体生长趋势,除盐酸羟胺组外,其他组均优于原始菌株组;紫外组胞外蛋白含量较原始组平均提高2.06倍,微波组平均提高1.24倍,吖啶组平均提高2.70倍,盐酸羟胺组平均提高1.60倍,复合诱变组平均提高3.30倍;盐酸羟胺组膜片失重率低于原始菌株组,其他组均高于原始菌株组,复合诱变组膜片失重率最大,高于原始组2.28倍;选择复合诱变组菌株UV-AO-1为优势菌株,PE降解60天后,UV-AO-1组水接触角比原始菌株组减小2.5°;拉伸强度减小3.37Mpa,断裂伸长率减少39.62%。转录组测序结果表明,此次共得到12372(63.24%)个非冗余Unigene,其中2095条Unigene富集于代谢过程组中;与COG数据库比对,有3328条Unigene与COG数据库中的基因具有同源性;涉及到代谢活动相关的Unigene占50.57%;发现差异表达基因423个,与G组相比,W组有293个基因表达上调,130个基因下调;Alk B基因差异表达最为显著。与KEGG Pathway数据库比对,有5776条转录本比对到KEGG数据库中,有92个代谢通路出现差异;碳代谢、氨基酸合成、丙酮酸代谢途径的差异基因表达上调数量较多,乙酰-Co A合成、脂肪酸代谢的相关基因表达差异上调显著,柠檬酸循环的差异基因下调明显。实时荧光定量PCR验证结果表明,荧光定量PCR得出的表达量与转录组测序结果的差异基因表达量上下调模式基本一致,证明此次转录组数据结果可信。综上所述,本研究菌株ZEL-1能够直接降解普通的低、中、高分子量的PE塑料;诱变菌株UV-AO-1的降解性能优于原始菌株,具有更大的应用潜力。原始菌株在PE碳源的培养条件下,菌株代谢倾向于碳架构建,减少了糖类物质的合成和代谢;推测菌株ZEL-1对聚乙烯的降解始于Alk B基因编码的烷烃单加氧酶对聚乙烯的末端氧化断链作用,经由脂肪酸β氧化,完成PE的无机矿化。ZEL-1降解聚乙烯的基因表达差异,基本反映了不同碳源引起的代谢通路差异,为后期深入研究聚乙烯降解机理提供了理论依据。
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【学位授予单位】：四川师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X172;Q78
【参考文献】
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