水稻白条纹叶白穗突变体基因WP4的图位克隆

发布时间：2018-12-09 20:00

【摘要】：水稻(Oryza sativa L.)作为单子叶模式植物,其功能基因组学是世界科学家研究的热点。叶色突变频率高,表型易于鉴定,已成为研究植物光合作用,叶绿素生物合成、降解,叶绿体的发育、结构、功能、遗传分化与调控的理想材料。以粳稻品种早香粳中发现的白条纹叶白穗天然突变体wp4为研究对象,对其进行了详细的生理学、细胞学和遗传学研究。结果表明wp4苗期叶片为白条纹状,分蘖期逐渐转绿。孕穗期剑叶、剑叶鞘出现严重白条纹,抽穗后突变体幼穗严重白化,但是成熟后发现育性正常;株高、穗粒数、单株产量显著低于野生型,而抽穗期、分蘖数及千粒重等性状与野生型无明显差异。叶绿素测定发现,wp4苗期叶片,幼穗、剑叶、剑叶鞘叶绿素含量显著低于野生型。突变体剑叶的净光合速率也明显低于野生型。对剑叶及幼穗细胞中叶绿体显微结构观察发现,突变体细胞中叶绿体数目显著下降,部分细胞中叶绿体发育不良或无叶绿体。突变体wp4与籼稻品种南京11、培矮64及粳稻品种日本晴的杂种F1叶片及幼穗颜色都表现正常,其F2群体中正常与白穗单株都出现3:1分离,表明wp4白穗性状符合单隐性基因控制的遗传规律。利用从wp4与南京11衍生的F2群体中挑选出来的2937株白穗突变体表型单株,将突变体基因定位在第八染色体标记dCAPS8-4与Z29之间8.65 Kb的区域内。基因预测发现该区域内只包含1个ORF(OsAK1),其编码蛋白为一个腺苷酸激酶(Adenylate kinase)。在突变体中的OsAK1表达量明显低于其野生型,但是序列比对发现wp4与野生型在OsAK1区域及整个8.65kb内,核苷酸没有差异。利用Ubi启动子驱动OsAK1基因cDNA及基因组DNA转化到wp4中,转基因植株都能恢复类似野生型的正常表型,因此说明OsAK1就是WP4基因。组织表达显示OsAK1在植物各个器官中都有表达,特别是在绿色组织中表达较高。亚细胞定位发现OsAK1编码蛋白定位在叶绿体中。Real time RT-PCR分析发现很多叶色与光合作用相关基因在wp4中下调,该结果说明OsAK1调控着水稻叶片叶绿素的合成与光合作用。本研究结果初步阐明了WP4调控水稻叶绿素合成、叶绿体发育及光合作用的分子机理。
[Abstract]:Rice (Oryza sativa L.) As a monocotyledonous model plant, its functional genomics is a hot topic in the world. Leaf color mutation frequency is high, phenotype is easy to identify, it has become an ideal material to study photosynthesis, chlorophyll biosynthesis, degradation, chloroplast development, structure, function, genetic differentiation and regulation. The white striped leaf white ear mutants (wp4) found in japonica rice variety Zaoxiang japonica were studied in detail in physiology, cytology and genetics. The results showed that the leaves of wp4 were white striped at seedling stage and turned green gradually at tillering stage. At booting stage, serious white stripes appeared in the flag leaf sheath, and the young spikelets of the mutant after heading were albino seriously, but the fertility of the mutant was normal after maturation. The plant height, grain number per spike and yield per plant were significantly lower than those of wild type, but there was no significant difference between wild type and heading stage, tiller number and 1000-grain weight. Chlorophyll content of leaf, young ear and flag leaf sheath in seedling stage of wp4 was significantly lower than that in wild type. The net photosynthetic rate of the mutant flag leaf was also significantly lower than that of the wild type. The microstructures of chloroplasts in flag leaves and young panicle cells were observed. It was found that the number of chloroplasts in mutant cells decreased significantly, while chloroplast development in some cells was hypoplastic or no chloroplast was found. The color of leaves and young panicles of hybrid F1 of wp4 and indica rice varieties Nanjing 11, Pei'ai 64 and japonica rice Nippon Qing were normal, and 3:1 segregation was observed between normal and white panicle plants in F2 population. The results showed that the white ear character of wp4 was consistent with the genetic rule controlled by single recessive gene. Using 2937 white spike mutants selected from F2 population derived from wp4 and Nanjing 11, the mutant gene was located in the region of 8.65 Kb between dCAPS8-4 and Z29 on chromosome 8. Gene prediction found that there was only one ORF (OsAK1) in the region, which encoded an adenylate kinase (Adenylate kinase). The expression of OsAK1 in the mutant was significantly lower than that in the wild type, but sequence alignment showed that there was no difference in nucleotide between wp4 and wild type in the OsAK1 region and in the whole 8.65kb. The transformation of OsAK1 gene cDNA and genomic DNA into wp4 by Ubi promoter could restore the normal phenotype similar to wild type in transgenic plants. Therefore, OsAK1 is WP4 gene. Tissue expression showed that OsAK1 was expressed in all plant organs, especially in green tissues. Subcellular localization revealed that OsAK1 encoded protein was located in chloroplasts by. Real time RT-PCR analysis and many leaf color and photosynthesis related genes were down-regulated in wp4. The results suggested that OsAK1 regulated chlorophyll synthesis and photosynthesis in rice leaves. In this study, the molecular mechanism of WP4 regulating chlorophyll synthesis, chloroplast development and photosynthesis in rice was preliminarily elucidated.
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S511

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本文编号：2369945