猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株N基因重组表达载体的构建及稳定表达细胞系的建立

发布时间：2018-12-12 01:35

【摘要】：本研究旨在建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)CH-HuN1301株N蛋白稳定表达细胞系。采用RT-PCR扩增PEDV新流行毒株CH-HuN1301株N基因,分别克隆至原核表达载体pET28a和真核表达载体pEGFP-C1构建重组表达载体,所测定的序列采用Mega 5.0软件进行进化分析。将原核表达的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,重组真核表达载体pEGFP-PEDV-N转染HEK293细胞,经用G418筛选获得稳定的表达细胞系。荧光倒置显微镜观察细胞荧光,免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测N蛋白的表达。结果表明,PEDV HuN1301-14毒株N基因大小为1 323bp,原核表达重组N蛋白分子质量约60ku,其多克隆抗体与PEDV呈特异性反应,荧光倒置显微镜观察和IPMA检测结果显示N蛋白在HEK293细胞中稳定表达。该细胞系的建立为进一步研究PEDV的诊断方法提供了基础材料。
[Abstract]:The aim of this study was to establish a stable expression cell line of N protein of porcine epidemic diarrhea virus (porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) CH-HuN1301 strain. The N gene of CH-HuN1301 strain was amplified by RT-PCR and cloned into prokaryotic expression vector pET28a and eukaryotic expression vector pEGFP-C1 respectively. The sequence was analyzed by Mega 5.0 software. The polyclonal antibody was prepared by immunizing rabbits with prokaryotic expressed N protein. The recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-PEDV-N was transfected into HEK293 cells and a stable expression cell line was obtained by G418 screening. Fluorescence inversion microscope was used to observe the fluorescence and immunoperoxidase monolayer (IPMA) was used to detect the expression of N protein. The results showed that the size of N gene of PEDV HuN1301-14 strain was 1 323 BP, and the molecular weight of recombinant N protein expressed in prokaryotic was about 60 ku.Its polyclonal antibody reacted specifically with PEDV. Fluorescence inverted microscope and IPMA analysis showed that N protein was stably expressed in HEK293 cells. The establishment of the cell line provides basic materials for further study on the diagnostic method of PEDV.
【作者单位】： 衡阳师范学院生命科学与环境学院;衡阳师范学院生物药物研究所;衡阳师范学院湖南益豚生态农业有限责任公司联合研究中心;
【基金】：国家自然科学基金青年基金(31101837) 衡阳师范学院引进人才专项项目(16D20) 湖南省教育厅优秀青年项目(17B038)
【分类号】：S852.651

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 ;唐都医院建立两株细胞系克隆3条基因片段[J];中国肿瘤;1999年07期

2 胡新立,尚克刚;6个小鼠ES细胞系的建立和鉴定[J];北京大学学报(自然科学版);1996年02期

3 甘烦远;郑光植;;植物培养细胞次级代谢产物高产细胞系的筛选[J];国外医药(植物药分册);1990年01期

4 沈超,郑从义,李朝阳,屈三甫;离体培养细胞系冷休克敏感差异性的研究[J];氨基酸和生物资源;2003年04期

5 颜永杉,冯尚,刘连瑞,甄惠欣,冯之凡;大鼠非致瘤四倍体细胞系的建立及细胞遗传学和酶学特征[J];遗传学报;1987年04期

6 韩嵘,陈伟胜,童英,尚克刚,孟令国;两个可进入种系的ES细胞系的建立[J];遗传学报;1999年03期

7 ;为再生医学提供高通量细胞系表征服务[J];办公自动化;2014年05期

8 张念慈;尹文林;沈锦玉;曹铮;顾志敏;;团头鲂尾鳍细胞系TQ-8801的建立[J];科技通报;1991年02期

9 马端端，王晓民，王昕红，，万有，陈光慧，韩济生;GDNF在多种细胞系中表达的研究[J];北京医科大学学报;1995年04期

10 舒世华;;APUD细胞系(讲座)[J];青海医学院通讯;1979年02期

相关会议论文 前10条

1 王官清;;水痘-带状疱疹病毒报告细胞系的构建及应用研究[A];中华医学会第16次全国皮肤性病学术年会摘要集[C];2010年

2 张秀军;;血源细胞系中P2Y受体的基因表达[A];中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集[C];2005年

3 徐淑平;何卓培;徐俊;罗士韦;;抗4-氧赖酸烟草细胞系变异的稳定性[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年

4 杨亮;张瑞军;魏海明;田志刚;;NK细胞系IL-2自分泌环路的验证及意义[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

5 田拥军;覃莉;张正茂;杨东亮;;稳定表达乙型肝炎病毒G145R变异表面抗原细胞系的建立与细胞性质的初步鉴定[A];中华医学会第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编[C];2005年

6 杨亮;张瑞军;魏海明;田志刚;;NK细胞系YT通过分泌IL-2进行自身调节[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

7 戴振鹏;高晓明;;建立人CD4~+CD25~+调节性T细胞系的免疫生物学特性[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

8 关卫卫;孙殿兴;;多种乙型肝炎病毒突变株可调控性表达细胞系的构建[A];第二届全国病毒性肝炎慢性化重症化基础与临床研究进展学术会议论文汇编[C];2012年

9 万莹华;司维柯;杜业军;李招权;潘静;赵宸;李军;粟永萍;;辐射对L929细胞生长及CCN1基因表达的影响[A];第九届西南三省一市生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2008年

10 王琳;刘文;刘妍;纪冬;思兰兰;钟彦伟;徐东平;;我国流行的C基因型HBV稳定复制表达细胞系的建立[A];第二届全国病毒性肝炎慢性化重症化基础与临床研究进展学术会议论文汇编[C];2012年

相关博士学位论文 前2条

1 郭华荣;海水鱼细胞系FG、SPH和RSBF的特性分析及其在典型海洋污染物毒性检测上的应用[D];中国科学院海洋研究所;2001年

2 张寰;昆虫脂肪体细胞体外增殖方法及同源病毒敏感脂肪体细胞系建立研究[D];中国林业科学研究院;2006年

相关硕士学位论文 前8条

1 徐秋萍;稳定表达乙型脑炎病毒NS2B/NS4B细胞系的构建及其在筛选互作蛋白中的初步应用[D];华中农业大学;2015年

2 钱雯琼;SPINK6在不同细胞系中的表达和定位[D];复旦大学;2012年

3 吴香菊;稳定高效表达猪CD163的MARC-145细胞系的构建及其应用[D];山东农业大学;2015年

4 杨曼曼;TRIM28基因克隆和可诱导稳定表达细胞系的建立及其可能的功能分析[D];泸州医学院;2014年

5 程丹丹;TBC1D15基因的敲除细胞系构建及其功能研究[D];浙江理工大学;2017年

6 关卫卫;多种乙型肝炎病毒突变株可调控性表达细胞系的构建[D];河北医科大学;2010年

7 秀花;组蛋白修饰在两细胞系上的分布分析[D];内蒙古大学;2013年

8 赵永祥;猪IRF1抗病毒功能的初步研究及稳定表达IRF1基因PK-15细胞系的构建[D];河南农业大学;2015年

本文编号：2373633