海洋弧菌Vibrio sp.SS-1褐藻胶裂解酶基因的异源表达与酶学性质研究

发布时间：2018-12-14 22:47

【摘要】：褐藻胶裂解酶是以海洋褐藻类中所含褐藻胶为底物制备具有多功能活性低聚褐藻寡糖的关键酶,对海藻资源的开发利用及水产养殖业具有很高的经济价值。实验从皱纹盘鲍的肠道中筛选出一株具有高效产褐藻胶裂解酶的优势菌株,通过菌株菌落形态特征观察,16S rRNA分子鉴定手段对菌株进行了鉴定,同时对该菌株的最适发酵条件、最佳培养基配方、褐藻胶裂解酶基因Alg的异源表达、酶学性质、分子特性等几方面进行了深入的研究,具体内容如下:1.产褐藻胶裂解酶菌株的筛选、鉴定与发酵条件的优化。通过平板透明圈法从皱纹盘鲍肠道为样品来源,筛选得到1株高效产胞外褐藻胶裂解酶的菌株SS-1,根据电子扫描显微镜观察菌株形态,菌落在平板中的形态特征以及16S rRNA基因的同源序列分析比对,鉴定该菌株为弧菌属,命名为Vibrio sp.SS-1,提交到NCBI中得到Genbank号为KX266239。通过以菌株的培养温度、pH、摇床转速及接种量作为实验单因素,确定了菌株SS-1的最适发酵温度为30℃,最适生长pH值为7.2,接种量1.5%,摇床转速180 r/min,并在最佳的培养条件下培养28 h后,其酶活力可达38.6 U/m L,比酶活力115.2 U/mg。2.海洋弧菌SS-1发酵培养基的优化。在菌株SS-1的最佳发酵条件下,以不同的C源、N源及无机盐等作为实验单因素,通过PB实验确定影响菌株产酶活力的显著性因素(麦芽糖、酵母粉及磷酸氢二钾),然后由最陡爬坡实验逼近最大响应值区域,采用BBD中心组合实验找到海洋弧菌SS-1的最佳发酵培养基配方为:麦芽糖11.86 g/L,酵母粉16.72 g/L,K2HPO_4 1.36 g/L,MgSO_4·7H_2O 1.5 g/L,FeSO_4·7H_2O 0.1 g/L,NaCl 6.75 g/L。在最佳培养条件下发酵培养,验证了酶活力达191.8 U/m L,比酶活力167.3 U/mg,相比较优化前酶活力提高了4.97倍。3.海洋弧菌SS-1褐藻胶裂解酶基因Alg的异源表达。以海洋弧菌SS-1总DNA为模板,运用PCR技术克隆得到褐藻胶裂解酶基因Alg,成功构建了重组表达菌株E.coli BL21(DE5α)/p ET28a(+)-Alg,经1 mmol/L IPTG进行诱导6 h,实现了重组蛋白的高效表达。诱导后的发酵液经超声破碎(功率15W,工作/间隙4s/8s,时间15 min)、Ni-NTA resin亲和层析纯化,检测到蛋白分子量38.0 kD,纯化倍数51.01倍,纯蛋白回收率26%,酶活力达187.5 U/m L,比酶活力为138.9 U/mg。4.重组褐藻胶裂解酶的酶学性质及分子特性研究。以pH及稳定性、反应温度及稳定性、金属离子、底物特异性、动力学方程等方面深入研究了酶学特性。结果表明重组酶的最适反应pH为8.0,在pH 4.0-9.0范围内,30℃条件下保温2 h,仍能保持60%以上的相对酶活力;最适反应温度为30℃,高于30℃条件下保温2 h,其残余酶活力损失40%以上;添加浓度1 mmol/L离子K+、Na+和Mg2+显示对重组酶有明显的促进作用,Cu2+、Fe3+、Ba2+、Fe2+、Al3+、SDS和EDTA等对该酶抑制作用较为明显;动力学参数Km为5.93 mg/mL,Vmax为826.44 mg/(m L·min),偏好降解底物Poly(M);电离喷雾质谱分析其降解褐藻胶产物主要不饱和二糖、三糖、四糖和五糖等小分子寡糖,其中以二糖的含量最高,因此说明,该重组酶是具有良好的酶学特性及有效底作用Poly(M)降解产生低聚寡糖的双功能内切酶,可应用于褐藻寡糖的制备。同时,采用生物信息学方法对Alg推断的序列重组酶蛋白进行理化特性分析,预测了海洋弧菌SS-1褐藻胶裂解酶基因Alg编码344个氨基酸,分子量约为38.8kD,等电点pI为4.80,其中带负电荷氨基酸Asp和Glu总个数为50,带正电荷的氨基酸Arg和Lys的总个数为34,故可推断为一种碱性蛋白酶,与酶学性质中重组蛋白理化性质结果相一致。利用SWISS-MODEL在线以3hhf.1.A为模板,模拟该重组酶的空间三维结构图,分子结构特性表明该重组蛋白酶为一种同源性为51.08%的低聚集单链的碱性蛋白酶分子,其中由大部分的不规则线性卷曲(约占44%)及少量的α-螺旋(约占27%)和β-折叠(约占27%)相互分散排列,由此推断该重组酶稳定性较差,与酶学性质存在一定相关性。具有高度保守序列“NTKYARSELRA”、“GQIH”,决定着重组酶的催化活性的关键氨基酸,为后续运用基因定点突变改造褐藻胶裂解酶提高酶活力值提供了很好的依据。与Vibrio sp.QY101蛋白序列相似度为54.13%,推断其可能是一种新的蛋白酶。随着褐藻胶裂解酶研究的不断深入,更多潜在的价值也会被不断发掘,该研究为褐藻胶裂解酶的酶学性质分析提供了很好的技术基础,为褐藻寡糖的制备提供很好的酶资源。
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【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ920.1

【参考文献】