黄瓜单性结实相关基因CsWDR36的克隆与表达研究

发布时间：2018-12-15 22:23

【摘要】：黄瓜(Cucumis sativus L.)是人们广泛种植的蔬菜作物之一,在生产和消费上具有重要地位。我国黄瓜的设施栽培面积很大,但在设施栽培条件下,低温弱光、高湿或雄花缺少等因素往往会造成黄瓜授粉受精不良,导致落花落果,严重影响了黄瓜的产量与品质,这也是目前我国黄瓜生产面临的主要的问题。单性结实是指子房不经过授粉受精而发育成果实的过程,因而单性结实性的品种不存在授粉受精不良等问题。研究黄瓜单性结实,可以发现新的单性结实基因资源,从而促进黄瓜栽培品种的改良。本研究以黄瓜单性结实材料'EC1'和非单性结实材料'8419s-1'为试验对象,基于黄瓜单性结实性状的QTL定位的主效区段,借助生物信息学分析方法发掘与黄瓜单性结实果实发育相关的基因,并结合RNA-Seq、重测序和表达分析预测与单性结实相关的候选基因。本文选取候选基因CsWDR36进行克隆,通过RT-PCR的方法明确该基因在果实发育早期、不同激素处理和不同器官组织中该基因的表达模式,并对其编码蛋白进行亚细胞定位研究;最后本文还对黄瓜中WDR基因家族进行全基因组关联分析。主要的研究结果如下:1黄瓜单性结实相关基因的预测与表达分析。本研究基于黄瓜单性结实性状QTL定位结果,对主效QTL区段内的98个基因进行生物信息学分析,发现35个基因与细胞周期、细胞生长以及激素信号传导等生物学过程有关。结合黄瓜单性结实转录组研究结果,共筛选出6个在黄瓜单性结实过程中转录水平有剧烈变化的基因。利用qRT-PCR技术分析这些基因在授粉、未授粉及单性结实的黄瓜果实发育过程中的转录变化,CsCRT1和CsCOL3基因在单性结实过程中呈上调表达,而在非单性结实品种授粉和败育中几乎不表达;CsWDR36基因在'8419s-1'授粉坐果中表达呈先升后降的表达趋势与化瓜中的先降后升正好相反,且在单性结实中呈下调表达,且下调表达的量随着天数增加而升高;说明CsWDR36、CsCRT1和CsCOL3可能为黄瓜单性结实过程候选基因。亲本'EC1'和'8419s-1'重测序结果发现CsJWDR36和CsSTK两个基因中存在大量的碱基突变位点,结合表达分析和重测序结果,推测CsWDR36为可能性最大的黄瓜单性结实候选基因,并以该基因开展后续研究。2黄瓜中WDR基因家族的全基因组关联分析。以保守的WDR基序在黄瓜基因组数据库中进行搜索比对,共检测到161个可能的WDR基因,经过比对验证确定142个。这些基因不均匀的分布在7条染色体上,每条染色体上分布的个数分别为28、16、32、19、16、19和12。按照基因所含其他结构域进行分类,可将其分为12类,其中仅含有WD基序的基因占70%左右;该基因家族的进化分析表明黄瓜中的WDR蛋白可被分为7个亚组,并预测第Ⅰ组基因的功能可能是与胚胎的发育和配子形成相关;第Ⅱ类基因可能是参与细胞分裂过程;第Ⅲ组基因可能在盐胁迫应答机制ABA信号途径中起作用;第V组中基因可能调节植物的生长发育;Ⅶa组基因可能与花青素合成有关;Ⅶb组可能是与干旱胁迫相关。WDR蛋白家族庞大,功能多样。其中CsWDR36-1和CsWDR36-2属于第Ⅲ组中,推测可能参与盐胁迫和脱落酸应答途径中。通过基因的功能注释分析黄瓜中WDR基因家族参与很多重要的生物途径以及大部分都集中在细胞部分。3与黄瓜单性结实相关基因CsWDR36的克隆与表达分析。以单性结实品种'EC1'和非单性结实品种'8419s-1'为材料,对CsWDR36基因进行CDS序列克隆,在两个黄瓜品种中CsWDR36基因都存在两个不同的转录本,大小分别为2676bp和1038bp,并命名为CsWDR36-1和CsWDR36-2;2个基因的生物信息学分析结果表明两个转录本的亲水性、跨膜结构、信号肽等理化性质相似,差异主要为WD40结构域的数目;与其他植物中WDR36蛋白进行序列比对和进化树分析发现该基因的蛋白序列与鹰嘴豆、油菜和甜瓜等的同源性较高,其中与甜瓜的亲缘关系最近,同源性高达82.15%;定量和半定量表达结果显示,在雌花和雄花中CsWDR36-1和CsWDR36-2的表达量要高于其他器官组织,且对激素处理不敏感;单性结实材料'EC1'和非单性结实材料'8419s-1'生长发育早期中两个转录本的表达趋势几乎一致,均为在'EC1'开花前表达量很低,在开花1d时达到峰值然后下降;且CsWDR36-2整体的表达水平高于CsWDR36-1。而'8419s-1'授粉中,两转录本也在开花1d达到峰值,但其峰值明显小于'EC1'中两转录本的表达量。因此推测CsWDR36-1和CsWDR36-2都可能参与了黄瓜单性结实的调控过程。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S642.2

【参考文献】