茶树黄酮醇糖苷积累的研究及CsFLS基因功能的验证

发布时间：2018-12-30 20:01

【摘要】：茶树多酚类物质是茶汤风味形成的主要成分,其中黄酮醇糖苷在茶的涩味中扮演着重要角色。茶树中游离的黄酮醇很少,多与糖基结合,形成黄酮醇糖苷类形式存在。黄酮醇合成酶基因(FLS)是黄酮醇合成的直接关键酶,与黄酮醇糖苷的积累是紧密相关的。本文首先对茶树中的黄酮醇糖苷进行了定性和定量分析,为进一步探索茶树中黄酮醇糖苷含量变化机理,本文还对茶树黄酮类物质积累的关键基因黄酮醇合成酶(FLS)的功能进行了验证。主要研究结果如下:1.茶树中黄酮醇糖苷的定性和定量分析。利用HPLC-TOF-MS鉴定了茶树鲜叶中15种黄酮醇糖苷;利用UPLC-QQQ-MS/MS的MRM模式建立了这些黄酮醇糖苷的定量方法;并通过六个黄酮醇糖苷的标准品对定量方法进行了评估,结果表明,在一定的浓度范围内,回归方程都具有很好的线性关系(R20.99);最低检测限和最低定量限分别小于0.01和0.03ng;回收率在90%和105%之间;保留时间和峰面积变化的日内相对标准差分别小于0.15%和3.9%;日间相对标准差分别小于0.26%和4%。表明该方法具有较高的灵敏度、良好的精密度和重现性。利用UPLC-QQQ-MS/MS的MRM模式建立的定量方法,研究了四个不同茶树品种不同组织发育阶段的黄酮醇糖苷的含量变化。相对定量结果发现,黄酮醇单糖苷,双糖苷和三糖苷主要积累在嫩叶中,少量积累在芽、成熟叶和幼茎中,其中槲皮素-3-O-芸香糖苷在成熟叶和幼茎中含量也很高。绝对定量结果发现,其中6种黄酮醇糖苷在不同组织发育阶段的绝对含量变化与相对定量的结果一致,主要积累在嫩叶中。此外,我们还发现这六个黄酮醇糖苷在老茎和根中的含量极少。2茶树黄酮醇合成酶功能的研究。本文克隆了3条茶树黄酮醇合成酶(CsFLS)基因,利用RT-PCR技术定量分析了3条CsFLS基因在不同组织发育阶段和不同诱导处理下的表达水平差异,结果表明,3条CsFLS基因在芽、一叶、二叶、成熟叶和3幼茎中都有表达;其中CsFLS1基因在芽中表达量最高,而CsFLS2和CsFLS3基因在二叶中表达量最高,它们在成熟叶和茎中表达量都较低;3条CsFLS基因的表达都受蔗糖和ABA诱导明显上调,而其他处理条件下,CsFLS基因表达量变化都不明显。为进一步验证它们的功能,实验将3条CsFLS基因整合到pRSFDuet-1载体上,构建成带组氨酸(His)标签的重组融合表达载体,并导入BL21大肠杆菌表达,再利用Ni柱纯化获得重组融合蛋白。HPLC体外酶活检测结果显示,3条重组CsFLS融合蛋白均可分别以DHK、DHQ和DHM为底物催化K、Q和M的产生;CsFLS2融合蛋白对于DHK、DHQ和DHM的Km值分别为22.9μM,80μM和65.55μM。构建了EHA105-pCB2004-CsFLS2载体,并利用农杆菌介导侵染烟草叶片,通过除草剂筛选获得了转基因植株。检测结果发现,转CsFLS2基因的烟草相比野生型,其花色明显变浅,花青素含量明显降低,而黄酮醇糖苷的含量增加。进一步在本氏烟幼苗叶片组织中瞬时表达带有GFP的CsFLS2基因,发现CsFLS2定位在细胞质和细胞核上。
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【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S571.1

【参考文献】