尼奥罗非鱼性腺发育、精子生物学及cyp19a1a基因表达与甲基化水平的研究

发布时间：2019-01-05 01:19

【摘要】：罗非鱼雄鱼生长明显优于雌鱼,生产上一般采用尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)♀×奥利亚罗非鱼(O.aureus)♂杂交获得高雄性率的杂种鱼-尼奥罗非鱼,雄性率高达95%以上。为进一步探讨杂种后代中雄性率偏移形成的机理。本论文观察了尼奥罗非鱼性腺发育、性别类型、精子形态结构与活力,以及在性腺发育阶段芳香化酶cyp19a1a基因mRNA表达及其启动子区域甲基化水平变化特征,为尼奥罗非鱼性别决定研究提供资料。通过组织学方法,研究了0.5-4.5月龄尼奥罗非鱼(尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂)的性腺发育特征与性别类型。结果表明,0.5月龄尼奥罗非鱼原始性腺尚未分化;1月龄,精巢中原始生殖细胞开始分化成精原细胞;2.5月龄出现初级精母细胞;3月龄出现次级精母细胞;3.5-4月龄精巢中存在不同发育阶段的生殖细胞,壶腹空腔中分散着稀疏的精子;4.5月龄精巢壶腹腔内密集大量精子。在2.5、3.5、4、4.5月龄抽样中,均检测到雌鱼,2.5-3.5月龄卵巢,以第Ⅱ时相卵母细胞为主;4-4.5月龄卵巢,以第Ⅲ时相卵母细胞为主。结果初步表明,尼奥罗非鱼杂种中观察到雄性、雌性两种性别类型,以雄性性别为主;杂种雌、雄鱼的性腺均能正常发育。通过扫描电镜观察尼奥罗非鱼及尼罗罗非鱼精子的外形特征,正常精子由头部、中段和尾部组成,均存在“正常型”、“短尾型”精子。用血球计数板测量了尼奥罗非鱼和尼罗罗非鱼的精子密度,分别为(2.39±0.43)×109个/mL、(4.38±0.57)×109个/mL。在不同梯度pH、K~+和Ca~(2+)离子条件下测定了精子的快速运动时间、寿命及激活率,尼奥罗非鱼、尼罗罗非鱼精子最适pH均在7.5左右,精子激活率均高于90%,尼奥罗非鱼精子快速运动时间和寿命均低于尼罗罗非鱼;K~+=100mmol/L时,精子快速运动时间最长,尼奥罗非鱼和尼罗罗非鱼精子分别为57.76±10.88s、64.69±9.10s,K~+=75mmol/L时,精子寿命最长,尼奥罗非鱼和尼罗罗非鱼精子分别为470.27±4.63s、513.97±5.33s,精子激活率最高。Ca~(2+)=37.6mmol/L时,尼奥罗非鱼和尼罗罗非鱼精子活力最高,精子快速运动时间分别为31.56±4.28s、40.56±4.28s,精子寿命分别为112.78±4.58s、116.11±7.43s。结果表明,尼奥罗非鱼精子形态正常,精子密度低于尼罗罗非鱼,在最适pH、K~+和Ca~(2+)离子条件下,尼奥罗非鱼精子活力显著低于尼罗罗非鱼(P0.05)。通过对尼奥罗非鱼转录组高通量测序,cyp19a1a基因CDS区序列与尼罗罗非鱼相同;通过cyp19a1a基因启动子及编码区PCR克隆测序,尼奥罗非鱼同尼罗罗非鱼具有相同的上游启动子及编码区序列。以尼罗罗非鱼性腺发育过程精巢、卵巢cyp19a1a基因mRNA表达作参照,40、60、80、120日龄尼奥罗非鱼精巢、卵巢cyp19a1a基因mRNA表达呈现下降的趋势,卵巢均高于精巢,其精巢、卵巢表达量均低于尼罗罗非鱼精巢、卵巢。对该基因启动子(SP1、SP2、SP3)BSP甲基化测序分析,尼奥罗非鱼精巢甲基化率高于卵巢,在发育过程中SP1与SP2的甲基化率并不相同,精巢中SP1、SP2都呈上升的趋势,卵巢中SP1呈上升趋势,SP2呈现下降后上升的趋势。120日龄的尼奥罗非鱼与尼罗罗非鱼SP3段甲基化率差异不明显。总体上来看,较尼罗罗非鱼,尼奥罗非鱼精巢、卵巢甲基化水平高于尼罗罗非鱼。
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【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

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