稳定表达绵羊NYD-SP27基因细胞系的建立及其慢病毒干扰载体的筛选研究

发布时间：2019-01-08 13:14

【摘要】：哺乳动物精子受精前需要在雌性生殖道内停留一段时间,期间精子的形态和生理会发生必要的变化,这样精子就会具备受精所需的能力,这个过程称之为获能。精子及时获能和产生顶体反应在自然受精过程中很重要,同样维持精子在受精前未获能状态也非常关键。时至今日,我们对哺乳动物精子获能的机制虽然研究甚多但是未知依旧很多。PLCζ在生殖发育中意义重大,其对精子的发生发育及卵母细胞激活等相关研究日益成为生殖发育的研究热点。PLCζ家族中的睾丸发育特异性蛋白-27 基因(testis development specific protein gene 27,NYD-SP27),被认为是一种新的精子内源性去能因子,目前已证实NYD-SP27在人类和小鼠精子获能上具有重要作用,但NYD-SP27在绵羊精子获能中的作用未见相关报道。本研究基于克隆绵羊NYD-SP27基因,探究该蛋白的表达特性,筛选高效的干扰片段,为揭示NYD-SP27在绵羊精子发生及获能中的作用机制提供一定的科学依据。[目的]本研究通过构建绵羊NYD-SP27基因的哺乳动物真核表达载体,构建稳定表达NYD-SP27蛋白的BHK-21细胞系,构建和筛选慢病毒干扰载体,为之后研究NYD-SP27表达上调、下调对绵羊精子发生及获能的影响提供相应的分子工具。[方法]从绵羊睾丸组织提取RNA,反转录后克隆绵羊NYD-SP27基因,扩增出P2A-Flag-NYDSP片段,并将其插入到真核表达载体pDsRed1-C1中,利用猪捷申病毒2A肽(P2A)将该蛋白和红色荧光蛋白连接以实现共表达,将重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP转染至BHK-21细胞,转染24小时后荧光显微镜观察转染效果,然后用G418筛选获得稳定转基因细胞株,利用基因组DNA进行 PCR 扩增、RT-PCR 扩增、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot对NYD-SP27基因的表达进行鉴定。将培养20代后的稳定细胞系BHK-SP27-21与正常BHK-21细胞比较形态和生长速度。针对绵羊NYD-SP27基因的序列,设计干扰NYD-SP27的短发卡RNA和阴性对照干扰RNA,并克隆至病毒干扰载体上,构建干扰绵羊NYD-SP27基因的慢病毒干扰载体PLL3.7-NYDSP-shRNA。将慢病毒干扰载体与包装质粒(VSVG、pMDL和REV)共转染HEK-293FT细胞,进行慢病毒包装,之后测定滴度,用慢病毒感染靶细胞BHK-SP27-21,利用荧光实时定量PCR检测目的基因的扩增,分析干扰效率,进而筛选出干扰效率高的干扰片段。[结果]扩增出绵羊NYD-SP27基因,经过测序比对,大小为1617bp,成功将P2A和Flag标签引入目的基因片段,成功构建了绵羊NYD-SP27的真核表达载体。基因组PCR和RT-PCR均能扩增出1617bp的特异性条带,结果表明,NYD-SP27基因稳定整合至宿主细胞基因组,IFA的结果显示实验组阳性细胞上可观察到绿色荧光,而阴性对照没有荧光。Western blot结果说明NYD-SP27蛋白能够在BHK-21细胞中正常表达,分子大小约为63 kDa,和预期结果一致,这样的大小也表明在NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白翻译过程中,P2A成功自我剪切,同时表明本实验构建的稳定细胞系正确。共设计4条干扰NYD-SP27的短发卡RNA和1条阴性对照RNA,并成功构建了相对应的干扰慢病毒载体,继而分别与辅助质粒一起包装出干扰慢病毒NYD-SP27 NYDSP-shRNA-LV,使用荧光实时定量PCR成功筛选出干扰效率较高的干扰片段NYDSP-shRNA-3。[结论]成功克隆出了绵羊NYD-SP27基因,构建了重组真核表达质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP,为后续试验提供了材料。成功建立了稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞系,将其命名为BHK-SP27-21细胞。成功筛选出干扰效率较高的干扰载体NYDSP-shRNA-1,并能显著降低绵羊NYD-SP27基因mRNA的表达量。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78;S826

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本文编号：2404644