应用piggyBac转座子系统在酿酒酵母中进行基因突变
发布时间：2021-03-04 02:19
PiggyBac(PB)转座子是来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的TTAA型转座子。PB转座子系统可作为一种插入型突变工具,应用于多种真核细胞中。传统突变方法包括紫外诱变和化学诱变等,其造成的突变位点随机,需要使用文库进行质粒回补或者定位克隆,操作复杂并且耗时较长。与传统突变方法比较,PB转座子插入型突变可利用转座子上的通用序列通过聚合酶链式反应(PCR)快速检测突变基因。目前,PB转座子系统已被用于在哺乳动物、植物、昆虫和裂殖酵母等物种中进行基因突变。然而,并未有研究报道在酿酒酵母中使用PB转座子系统进行基因突变。本研究在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中构建了一个基于PB转座子的筛选系统用于进行体内突变。这个转座子系统由两部分组成,分别是插入ADE2基因编码框的3?PB-TEFp-HIS3-5?PB转座子,以及由半乳糖启动子调控表达的PB转座酶(PBase)。通过在半乳糖培养基中诱导PBase表达,PB转座子可以从原始插入位点无痕移除并随机再次插入新的基因位点。PB转座子在转座过程中保持单一拷贝数,在单个细胞中只导致一个突变位点,并可快速检测该突变基因。实验结果表明本研究所构建的PB转座子系统可用于酿酒酵母中,通过插入突变实现基因筛选。为了检验所构建的PB转座子系统用于在酵母体内进行筛选的效率,本研究将此筛选系统用于筛选与高尔基体α-1,6-甘露糖基转移酶(Och1p)定位有关的基因。Och1p定位于顺面高尔基体,它可以运输至反面高尔基体,之后再通过逆运输机制回到顺面高尔基体。虽然已有研究探索与Och1p运输至顺面高尔基体有关的机制,但关于Och1p定位的调控机制尚不清楚。作者构建了截短型Och1-Suc2融合蛋白,在蔗糖酶缺失(suc2Δ)的酵母菌株中表达这一融合蛋白,由于大量融合蛋白停留在高尔基内,该菌株在蔗糖平板上生长缓慢。如果经过突变导致Och1-Suc2融合蛋白被分泌到或定位到细胞表面,该突变菌株在蔗糖平板上可具有较快生长速率。利用这一生长缺陷以及PB转座子筛选系统,作者筛选得到在蔗糖平板上具有较快生长速率的突变株M6。在M6突变株中PB转座子插入SCY1基因启动子区域,该突变株中SCY1基因表达量约为亲株的70%。研究发现过量表达Scy1p导致截短型Och1p进入液泡,使高尔基体中截短型Och1p蛋白量下降,同时影响蔗糖酶的糖基化及分泌。根据筛选结果及后续实验推测SCY1基因与Och1p定位相关。进一步证明利用PB转座子系统在酿酒酵母中进行突变能有效筛选控制相应表型的目的基因。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78
本文编号：2415550
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78
文章目录
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 酿酒酵母中基因突变方法概述
1.2 PiggyBac转座子介绍
1.2.1 国内外piggyBac转座子应用进展
1.2.2 PiggyBac转座子结构及转座原理
1.3 高尔基体 α-1,6 甘露糖基转移酶（Och1p）简介
1.4 SCY1基因简介
1.5 本论文研究意义和主要内容
1.5.1 本论文研究意义
1.5.2 本论文主要内容
第二章 材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株
2.1.2 质粒
2.1.3 引物
2.1.4 本研究所用试剂
2.1.5 培养基、试剂配制
2.1.6 主要设备
2.2 实验方法
2.2.1 感受态细胞制备
2.2.2 质粒构建
2.2.3 质粒定点突变
2.2.4 质粒一步转化
2.2.5 线性转化敲基因
2.2.6 点板实验
2.2.7 酿酒酵母膜蛋白提取
2.2.8 TCA沉淀蛋白
2.2.9 蛋白质免疫印迹（Western blot）
2.2.10 荧光定位
2.2.11 生长曲线测定
2.2.12 PB转座子移除率和再插入率计算方法
2.2.13 PB转座子筛选方法
2.2.14 从突变株移除PB转座子
2.2.15 巢式聚合酶链式反应验证单个突变株中PB插入位点
2.2.16 下代测序法验证PB插入位点
2.2.17 Southern印迹杂交（Southern blot）
2.2.18 荧光定量PCR
第三章 结果与讨论
3.1 酿酒酵母菌株中PB转座子筛选系统的构建
3.1.1 PB转座子系统结构及转座原理
3.1.2 转座系统中PB移除率和再插入率
3.1.3 转座过程中PB转座子拷贝数的检测
3.1.4 下代测序技术分析PB插入位点
3.2 截短型Och1-Suc2-Flag融合蛋白以及蔗糖酶分泌系统的构建
3.2.1 截短型Och1-Suc2-Flag融合蛋白结构
3.2.2 截短型Och1p仍定位于顺面高尔基体
3.2.3 应用蔗糖酶分泌系统对突变菌株进行筛选
3.3 SCY1基因影响Och1p定位
3.3.1 PB筛选得到SCY1基因
3.3.2 过量表达SCY1基因使高尔基体中截短型Och1p蛋白量下降
3.3.3 过量表达SCY1基因导致蔗糖酶糖基化缺陷及分泌量减少
3.3.4 过量表达SCY1基因使截短型Och1-Suc2-Flag融合蛋白进入液泡
主要结论与展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录：作者在硕士期间发表的论文
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 徐沙;中西秀树;高晓冬;;糖蛋白药物表达系统糖基化研究进展[J];微生物学报;2013年03期
2 杨欢欢;魏峰;刘全;;piggyBac转座子应用研究进展[J];动物医学进展;2010年12期
3 盛翠;张一平;陆茂林;;原生质体紫外诱变选育鸟苷高产菌株[J];食品与生物技术学报;2009年02期
4 代红久,徐国江,Thomas ean-luc,王铸钢,蒋容静,费俭;利用鳞翅目来源的转座子piggyBac建立高效稳定的转基因家蚕技术[J];科学通报;2005年14期
本文编号：2415550
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