空肠弯曲菌新基因cj0371突变株特性分析及其在趋化通路中的作用研究

发布时间：2019-02-22 13:11

【摘要】：空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是革兰氏阴性菌,微需氧菌,是世界范围内引起人类胃肠炎的主要食源性病原菌之一。目前对于空肠弯曲菌为什么能够定殖在家禽肠道中与之共生及为什么会导致人类患病仍然知之甚少。目前虽可以轻而易举获得不同空肠弯曲菌的基因组信息,但是若要全面了解空肠弯曲菌的致病机制还需要更多的研究。相比其他腹泻性致病菌,空肠弯曲菌没有很多典型的毒力因子,但是一些非典型的毒力因子却比比皆是。本实验室曾使用体内诱导抗原技术(IVIT)筛选空肠弯曲菌感染人或鸡时所表达的毒力相关基因,cj0371就是通过此方法筛选到的一个特异性基因。本文在实验室前人构建了cj0371突变株的基础上,就该突变株做了多种生物学特性分析及毒力评估,初步评价了Cj0371蛋白的免疫学特性;同时对该基因可能的作用通路—趋化通路做了深入探究,为空肠弯曲菌致病机制的研究增添了新信息。一、空肠弯曲菌cj0371突变株生物学特性分析本文首先对cj0371基因的功能位点进行细胞亚定位,使用激光共聚焦显微镜观察发现融合蛋白Cj0371-GFP在空肠弯曲菌的两极发光;另外细胞质膜蛋白亚定位发现Cj0371在细胞质和细胞膜中都有存在,因此推测Cj0371可能是一个跨膜蛋白;半固体平板运动力分析实验显示,cj0371突变株的运动力大于野生株的运动力,回复株运动力较野生株和突变株都弱;使用透射电镜观察突变株和野生株的鞭毛没有发现差异。本研究还测试了突变株与野生株的生长曲线,结果显示突变株的生长速度大于野生株,且从培养6h开始,突变株和野生株的生长速度有显著性差异。使用硬琼脂法进行趋化性分析结果显示以DL-苹果酸、a-酮戊二酸和丁二酸作为诱导性趋化物时突变株的趋化能力均大于野生株。突变株毒力分析实验包括体外黏附侵袭实验、体内定殖实验及感染细胞炎性因子定量分析实验等。体外黏附侵袭实验结果表明,突变株的黏附侵袭力大于野生株,尤其是侵袭力与野生株之间具有极显著差异(P0.01)。仔兔定殖实验结果显示突变株的定殖力大于野生株,且在定殖48 h时,具有显著性差异(P0.05)。突变株和野生株刺激细胞后炎性因子定量分析实验选择的细胞模型是禽类巨噬细胞HD11和小鼠腹腔巨噬细胞,测定的炎性因子有IL-6,IL-1β及趋化因子等;无论是HD11还是小鼠腹腔巨噬细胞,经空肠弯曲菌刺激后炎性因子表达都显著上调,但是突变株和野生株之间并没有显著性差异。将Cj0371蛋白表达纯化后同样刺激以上两个细胞模型,刺激HD11细胞后趋化因子和iNOS基因显著上调,但是IL-6,IL-1β等表达量变化没有差异,而小鼠腹腔巨噬细胞的IL-6,IL-1β等都有显著上调表达。二、cj0371基因在空肠弯曲菌趋化通路中的作用研究为深入研究cj0371基因的功能,本研究设计了免疫共沉淀偶联质谱分析实验,筛选与Cj0371蛋白相互作用的已知蛋白,根据已知蛋白的信息来推测Cj0371蛋白的功能。质谱分析实验共得到40多个疑似蛋白,主要集中在趋化通路、代谢通路。本研究选择趋化通路继续深入研究。首先通过qRT-PCR方法定量检测突变株和野生株中趋化通路基因及受趋化通路影响的鞭毛基因的表达量,实验结果显示,突变株中cheV、cj1110c、cj1564和cj0262c等趋化通路基因无论是在细菌生长早期还是晚期都上调表达;鞭毛基因在细菌生长早期鞭毛基部基因上调表达。尤其是其表达量始终显著大于野生株(12h,P0.05;24h,P0.01)。其次,将趋化通路基因cheV、cheA、cheY、cj1110c、cj1564、cj0262c进行原核表达,并使用体外GST pull-down技术分别验证与Cj0371蛋白的相互作用,结果表明只有CheV蛋白与Cj0371蛋白有相互作用关系。另外本研究将CheV、CheA、CheY、Cj0371、Cj6462等蛋白纯化后体外模拟空肠弯曲菌趋化通路并使用酶连分光光度分析法检测了在通路中有Cj0371存在与不存在于趋化反应液中时CheA蛋白ATPase活性变化,结果显示在不含有Cj0371蛋白的趋化反应液中,系统消耗ATP速率更快;同时检测了在添加和未添加CheV蛋白于趋化反应系统中时CheA蛋白ATPase活性的变化,实验结果只能说明CheV在趋化通路中具有重要作用,但不能说明CheV和Cj0371蛋白间的关系。最后本研究还解析Cj0371与CheV相互作用的结构域,原核表达了 CheV的CheW-like结构域和反应调控结构域,并用GST pull-down技术验证CheV蛋白的哪个结构域与Cj0371蛋白相互作用;实验表明Cj0371蛋白与CheV的反应调控域结合。推测cj0371基因是通过调控cheV来影响细菌趋化性,进而影响细菌生长,鞭毛运动等生物特性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378

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本文编号：2428262