太平洋鳕发育早期干扰素通路相关基因的克隆分析及表达规律的研究

发布时间：2019-03-20 08:17

【摘要】：太平洋鳕(Gadus macrocephalus)是我国重要的海水经济鱼类。随着海洋渔业的快速发展,太平洋鳕野生资源不断下降,人工繁育亟待展开。本实验室太平洋鳕人工育苗技术日渐成熟,并在育苗过程中发现太平洋鳕在仔鱼期出现大批量死亡现象。为探究这一现象,本实验对干扰素系统的信号通路进行初步研究,并通过对干扰素系统相关基因TLR3,MDA5,IPS1,IRF3,IRF7和ATG5基因的转录水平的测定来衡量干扰素系统在太平洋鳕早期发育中的表达规律,为太平洋鳕人工育苗早期的疾病防治提供理论基础。本实验根据实验室已获得的转录组信息对TLR3,MDA5,IPS1,IRF3,IRF7和ATG5基因设计扩增引物,以太平洋鳕成鱼的肾组织为实验材料,通过基因克隆测序,获得目的基因片段。为探究干扰素系统在太平洋鳕早期发育中的作用特点,本实验建立了绝对荧光定量PCR检测方法,分别对6个目的基因在太平洋鳕各组织和太平洋鳕仔鱼期中的表达规律进行了检测。此外,本实验利用Poly(I:C)分别对太平洋鳕2日龄和12日龄仔鱼进行浸泡,分别对目的基因进行诱导表达,并对相同基因的表达差异进行了分析。实验结果如下:太平洋鳕TLR3基因cDNA序列长3322bp,不包含完整阅读框(Open reading frame,ORF),序列中最长阅读框编码377个氨基酸。通过绝对荧光定量PCR检测太平洋鳕各组织中TLR3的表达水平结果显示,标准曲线的回归方程以及回归系数为:y=-3.1475x+36.756 R2=0.9962;TLR3基因在太平洋鳕的各组织中均出现了表达,其中肝中TLR3的的表达量显著高于其他组织,在心脏和胸腺中表达量其次,在鳃,脑和肌肉中表达量较少。太平洋鳕MDA5基因cDNA序列长2604bp,不包含完整阅读框,序列中最长阅读框编码844个氨基酸。通过绝对荧光定量PCR检测太平洋鳕各组织中MDA5的表达水平结果显示,标准曲线的回归方程以及回归系数为:y=-3.2154x+36.154 R2=0.9949;MDA5基因在太平洋鳕的各组织中均出现了表达,其中肾中MDA5的表达量显著高于其他组织,在心脏,肠和脾中表达量其次,在脑和肌肉中表达量较少。太平洋鳕ATG5序列长895bp,含有完整的开放阅读框,编码275个氨基酸,其编码的蛋白质分子量约为32.2kDA。经核苷酸序列比对发现,太平洋鳕ATG5与半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)ATG5的相似性均高达87.27%。利用太平洋鳕与其它物种ATG5核苷酸序列构建系统进化树,结果表明ATG5系统进化树反映的亲缘关系基本符合传统分类学观点,氨基酸序列分析结果显示了ATG5具有较高的保守性。通过绝对荧光定量PCR检测太平洋鳕各组织中ATG5的表达水平结果显示,标准曲线的回归方程以及回归系数为:y=-2.8646X+31.989 R2=0.998;ATG5基因的转录在太平洋鳕的各组织中都有表达,肝、脾和肾表达量高于其他组织。太平洋鳕IPS1基因cDNA序列长1539bp,不包含完整阅读框,序列中最长阅读框编码161个氨基酸。通过绝对荧光定量PCR检测太平洋鳕各组织中IPS1的表达水平结果显示,标准曲线的回归方程以及回归系数为:y=-3.1287x+34.206 R2=0.9868其中肾和肝中IPS1的的表达量显著高于其他组织,在胸腺,肌肉中表达量其次,在脑和鳃中表达量较少,其中在脑中的表达量最少。太平洋鳕IRF3序列长1878bp,包含完整开放阅读框,长1377bp,编码459个氨基酸,其编码的蛋白质分子量约为51kDa。经氨基酸序列比对发现太平洋鳕IRF3的氨基酸序列包括1个含有5个保守色氨酸残基的DNA结合域(DNA binding domain,DBD)和1个保守的C端IRF关联域(IRF association domain,IAD);系统进化树分析表明太平洋鳕IRF3与其他物种的IRF3亲缘关系较近。通过绝对荧光定量PCR检测太平洋鳕各组织中IRF3的表达水平结果显示,标准曲线的回归方程以及回归系数为:y=-3.3449X+41.001 R2=0.9896;各组织绝对定量结果显示性腺,肝和胸腺表达量高于其他组织。太平洋鳕IRF7序列长为2032bp,包括一个38bp的5'UTR和一个668bp的3'UTR,含有完整ORF,长度为1323bp,编码440个氨基酸,分子量约为50118Da,序列中含有一个polyA加尾信号(AATAAA),5个mRNA不稳定信号(ATTTA);经氨基酸序列比对发现太平洋鳕IRF7 N端有个保守的DNA结合域,包含4个保守的色氨酸(W)重复,C端具有一个较保守的IRF关联域,羧基末端具有丝氨酸富含域(serine-rich domain SRD);系统进化树分析表明太平洋鳕IRF7与大西洋鳕IRF7亲缘关系与进化关系最近。通过绝对荧光定量PCR检测太平洋鳕各组织中IPS1的表达水平结果显示,标准曲线的回归方程以及回归系数为:y=-3.2881x+43.399,R2=0.9904;各组织绝对定量结果显示脾,肾和胸腺表达量高于其他组织。实验根据采集受精卵时期到33dph时期的太平洋鳕仔鱼,应用绝对荧光定量PCR方法,以分析仔鱼期太平洋鳕TLR3,MDA5,IPS1,IRF3,IRF7的表达规律。结果显示,TLR3,IRF3,IRF7均在25dph阶段表达量出现明显上调,TLR3,MDA5,IPS1均在1dph阶段表达量出现明显上调,其他阶段各基因表达稳定,这表明1dph和25dph是太平洋鳕免疫关键时段,干扰素对病害的防治起到重要作用。实验通过Poly(I:C)对2dph和12dph仔鱼进行浸泡,并采集3H,6H,12H,24H,48H,72H阶段仔鱼,应用相对定量PCR方法,以分析太平洋鳕仔鱼TLR3,MDA5,IPS1,ATG5,IRF3,IRF7在Poly(I:C)诱导下的表达规律。结果显示,太平洋鳕仔鱼TLR3,MDA5,IPS1,ATG5,IRF3,IRF7在经Poly(I:C)处理后出现了不同程度的上调表达,多在48H和72H阶段表达量达到最大值。
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【学位授予单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
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本文编号：2444025