棉花GhPCBER1基因的克隆与功能初步分析

发布时间：2019-03-23 18:49

【摘要】：棉花是全球性的重要经济作物,棉纤维是纺织工业最主要的天然纤维来源,棉纤维质量和产量是棉纺织产业经济发展的有效动力,棉纺织品的质量和收益与棉纤维品质有密不可分的关系。如何提高棉纤维品质是棉花育种要解决的一个重要问题。棉纤维品质是在棉纤维发育的过程中形成的,研究发现,在棉纤维的发育过程中存在苯丙烷代谢途径,是纤维中仅次于纤维素代谢的第二大代谢途径,该途径产生的次生代谢产物可能对棉纤维的发育与品质形成具有重要影响,因此,对该途径关键基因克隆及其分子机制研究,将为明确纤维品质形成机制及利用基因工程手段改良棉纤维的品质奠定理论基础。PIP亚家族基因编码的蛋白是苯丙烷代谢中木脂素、黄酮、异黄酮类等次生代谢产物合成的重要酶,其中苯基香豆满苄基醚还原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase,PCBER)是苯丙烷代谢产物木脂素合成过程中的关键酶,PCBER基因在棉花的根、茎、叶、花、种皮和纤维中均有的表达,那么在棉纤维的发育中发挥着什么样的生物学功能?本研究以PCBER氨基酸序列为探针,利用生物信息学和分子克隆技术从棉纤维中克隆到6个PIP亚家族成员,研究PIP亚家族在棉花不同组织中的表达情况,同时将PIP亚家族成员GhPCBER1基因在拟南芥中异位表达和棉花中过量表达,以期对该基因的功能进行初步分析,结果如下:1.以PCBER氨基酸序列为探针,利用Blastp从陆地棉基因组数据库中发现了6个同源性较高的基因。根据6个基因序列设计引物,利用RT-PCR技术从陆地棉纤维细胞中克隆出了这6个基因的全长cDNA序列,分别命名为GhPCBER1、GhPCBER2、GhPCBER3、GhIFR、GhPLR1和GhPLR2。生物信息学分析发现,6个基因编码306~313个氨基酸,蛋白分子量为33 854.9~35 199.6 Da,蛋白的亲水性较强且无信号肽,是非分泌蛋白,对亚细胞定位预测PIP蛋白定位于细胞质中,6个蛋白均含有PIP类型蛋白的所有保守性基序和活性残基,属于PIP亚家族。实时荧光定量PCR结果显示,6个PIP亚家族基因均在纤维发育次生壁合成期表达量较高,其中GhPCBER1在纤维中优势表达,根据基因的表达特征,推测其可能在棉纤维的发育过程中发挥着重要作用。2.构建了原核表达载体pET-28a-GhPCBER1,酶切鉴定并测序正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。使用浓度为1 mmol/L的IPTG在不同时间梯度下诱导,SDS-PAGE鉴定表达产物。结果表明,37℃诱导4h蛋白表达量最大,表达的蛋白相对分子量约为34.7k D,说明pET-28a-GhPCBER1构建及诱导表达成功,为下一步研究该基因的功能奠定了基础。3.为探究GhPCBER1的功能,利用Gateway技术构建植物过表达载体和抑制表达载体,将过表达载体通过农杆菌蘸花法转化拟南芥,对抗性植株进行PCR验证,收获抗性植株的种子,继续用抗生素筛选,直至获得纯合体,提取拟南芥RNA反转录cDNA后,进行qPCR分析,选出GhPCBER1表达量高的株系,为后续研究做准备。4.GhPCBER1基因过表达和RNAi抑制表达转化陆地棉品种YZ-1,对侵染后的棉花下胚轴进行组织培养和抗性筛选,得到胚性愈伤,进一步诱导分化成幼苗,PCR验证后得到阳性棉花植株,为今后进一步研究GhPCBER1在棉花中的功能奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S562

【参考文献】