香蕉枯萎病菌2小种间pme1和pme2基因比较和功能研究

发布时间：2019-05-10 01:34

【摘要】：香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起的维管束系统性病害,对香蕉生产造成毁灭性的破坏,引起巨大的经济损失。香蕉枯萎病菌1号小种(Foc1)广泛分布于世界各地,主要侵染粉蕉(Musa AAB);香蕉枯萎病菌4号小种(Foc4)几乎能感染所有的香蕉品种,为害最严重。尖孢镰刀菌在与寄主相互作用时会产生一些与致病性密切相关细胞壁降解酶(Cell wall degrading enzymes,CWDEs),降解寄主的细胞壁防御和保护组织,其中,果胶酶在致病过程中起着重要作用。在本研究室已获得3种碳源诱导条件下香蕉枯萎病菌2个小种转录组差异分析结果的基础上,将转录组结果中功能注释为果胶甲酯酶基因的comp12226_c0、comp14619_c0在进行BLAST比对,表明均属于Pectinesterase家族基因,与串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)同源性为92%、93%,分别命名为pme1和pme2。转录组结果分析显示pme1和pme2基因在2小种表达量差异较明显,且在Foc4中的表达量均高于Foc1。通过Quantitative Real-time PCR验证,pme1在Foc4的表达量是Foc1的300-500倍,pme2在Foc4的表达量是Foc1的100-700倍,qPCR结果与转录组分析结果相符。基因克隆测序显示:Foc1-pme1和Foc4-pme1 DNA序列均为1141 bp,编码区均为990 bp,编码区同源性为98.7%,均为2个内含子和3个外显子组成。Foc1-pme2和Foc4-pme2 DNA序列均为1321 bp,编码区均为1221 bp,编码区同源性为98.5%,均为2个内含子和3个外显子组成。pme1和pme2编码蛋白属于Pectinesterase家族蛋白,均定位于细胞外,pme1保守区域为26-315aa,pme2保守区域为57-381aa,氨基酸功能位点均为IQGATDFIFG,均有糖基化位点和磷酸化位点。PME1、PME2同工酶基因转化到酵母Pichia pastoris GS115中进行真核表达。以1%甲醇诱导目的基因表达,收集上清液,通过SDS-PAGE分析。结果表明:目的基因在24 h已经开始表达,通过western blot再次验证目的基因表达。连续分光光度计法和琼脂糖扩散法测定粗蛋白酶活,结果表明重组蛋白可以降解高度酯化的果胶,在果胶培养基中可检测到水解圈,表明获得具有活性的重组蛋白。利用hiTAIL-PCR获得目的基因上下游同源臂,通过同源重组的方法构建了Foc1-pme1、Foc4-pme1、Foc1-pme2和Foc4-pme2基因敲除载体,利用ATMT方法进行转化,成功获得基因缺失突变体。采用浸根接种的方法,将敲除突变体接种寄主,观察记录结果45 d,敲除突变体和野生菌株接种的寄主都出现典型的香蕉枯萎病症状。虽然突变体的病情指数与对应的野生型相比有所降低,但统计分析表明,突变体与野生型之间的病情指数没有显著差异,说明敲除单个PME基因对Foc1和Foc4的致病力影响不大,PME基因不是Foc1和Foc4侵染寄主的关键致病因子,但与病害的严重度可能有一定的关系。
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【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.68

【参考文献】

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本文编号：2473248