IL-21基因修饰的人脐带间充质干细胞联合miR-200c抗卵巢癌作用研究

发布时间：2019-06-08 14:20

【摘要】：上皮性卵巢癌一直是妇科恶性肿瘤中致死率最高的一类肿瘤,被认为是一个“沉默杀手”。它起病隐匿、进展迅速,70%以上的患者在诊断时已处于晚期,肿瘤已发生广泛盆腹腔或远处转移,5年生存率仅有30%。所以,寻找早期诊断及早期治疗方法,一直是妇科临床医生与妇科肿瘤基础研究者多年来的工作重点。当前,上皮性卵巢癌的治疗为手术治疗辅助以铂类药物为基础的化疗,但是,现有的治疗方法未能取得满意效果,由于化疗耐药而导致的卵巢癌治疗失败成为难以克服的问题。因此,寻找卵巢癌治疗新途径十分必要。近期,越来越多的学者把目光投向基因治疗,作为一种新兴的治疗方法,基因治疗为上皮性卵巢癌患者带来了希望。随着人类对上皮性卵巢癌增殖、转移相关分子机制研究的不断深入,上皮性卵巢癌的基因治疗和细胞移植免疫治疗已成为该领域新的研究热点。目前已有越来越多的学者尝试采用不同的研究方法,应用不同的研究途径对肿瘤的靶向性治疗进行广泛深入的研究与探索,一些研究已在动物实验中取得了相当大的进展,甚至一些肿瘤的基因治疗和细胞移植免疫治疗策略已经进入临床应用阶段。但基因治疗和细胞移植免疫治疗方法作为肿瘤治疗的新手段仍有待于进一步成熟,需要进一步深入的研究与探索。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是近期研究发现的一种具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞。目前很多研究发现,MSCs具有肿瘤组织趋向性,可以作为肿瘤靶向治疗的载体细胞。研究发现,人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)不会促进实体肿瘤的生长和浸润,在肿瘤治疗中更为安全。hUCMSCs不仅可作为肿瘤靶向治疗的载体,还可通过调节Wnt/β-catenin信号途径发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。白细胞介素21 (interleukin-21, IL-21)是具有多种生物学功能的重要免疫调节因子,能介导固有性免疫向适应性免疫转换,参与体液免疫和细胞免疫应答。IL-21能够促进脐血祖细胞转化为NK细胞,促进B、T细胞增殖,并使其对靶细胞的细胞毒性增加。越来越多的研究已经证实IL-21细胞因子在抗肿瘤治疗中具备强大的免疫调节潜能。细胞基因修饰在基因治疗中一直为人们所关注,并将逐步成为治疗多种疾病的一种重要手段。因此,我们将IL-21构建于含有增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen上,将重组慢病毒体pHAGE-IL-21用于基因修饰的治疗性实验中,并对其效应机制进行了初探。microRNA(miRNA)是近期发现的一类非编码小分子RNA,通常在转录后水平调控基因表达。miR-200 家族(miR-141、miR-429、miR-200a、miR-200b、miR-200c)是新近发现的肿瘤转移相关miRNA,系列研究发现它们能够通过调控上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)影响肿瘤细胞的转移能力。研究发现卵巢癌中存在miR-200c表达异常,miR-200c表达下调可能与卵巢癌进展相关,并且可能是卵巢癌的不良预后因素之一。目前,卵巢癌的基因治疗仍大部分停留在动物实验阶段,在进入临床应用前尚有诸多需要解决的问题,譬如:如何选择更有效的目的基因;如何使得带有治疗作用的重组载体高效率地转移,并长期稳定地高表达基因产物;怎样有效地将基因治疗与其它治疗方法联合应用等。基于对以上问题的考虑,设计了本研究课题,即采用慢病毒携带IL-21基因转导hUCMSCs,并联合miR-200c共同发挥抗卵巢癌作用。1.目的本研究旨在将基因治疗和细胞移植治疗相结合,采用慢病毒携带IL-21基因转染hUCMSCs,通过hUCMSCs将具有抗肿瘤效应的IL-21细胞因子携带到肿瘤部位,使hUCMSCs、IL-21与miR-200c三者联合共同发挥抗卵巢癌的作用,并探讨和分析其可能的作用机制,以期为临床使用miR-200c联合hUCMSCs-IL-21基因治疗卵巢癌提供实验依据。2.方法2. 1构建含IL-21基因的重组质粒pHAGE-IL-21,并对其进行鉴定。随后以重组质粒包装慢病毒,并对其进行鉴定,为后续实验奠定基础。2.2原代培养hUCMSCs,并通过表面分子标记及成骨、成脂实验鉴定hUCMSCs特性。2.3重组慢病毒pHAGE-IL-21转导hUCMSCs,检测转导后的hUCMSCs中IL-21的表达及活性。2.4体外实验:1) miR-200c mimic转染SKOV3并鉴定;2)细胞隔离共培养:将需要共培养的细胞分别接种于“Trans-well”体系中,分七组进行实验:培养液对照组、hUCMSCs组、未插入IL-21基因片段的慢病毒转导hUCMSCs(hUCMSCs-LV-Vec)组、插入IL-21基因片段的慢病毒转导hUCMSCs (hUCMSCs-LV-IL-21)组、miR-200c 组、hUCMSCs-LV-IL-21 联合 miR-200c 组和顺铂(DDP)组;3) MTT法测定各组上室内细胞增殖情况;4)划痕试验检测细胞迁移能力;5) Transwell小室基质胶侵袭试验检测细胞侵袭力。2.5建立人卵巢癌细胞株SKOV3裸鼠移植瘤模型,成瘤后将荷瘤裸鼠分七组进行后续治疗实验:生理盐水对照组、hUCMSCs组、hUCMSCs-LV-Vec组、hUCMSCs-LV-IL-21 组、miR-200c 组、hUCMSCs-LV-IL-21 联合 miR-200c 组和顺铂组。经治疗后观察移植瘤大小、肿瘤病理及裸鼠脏器情况;取裸鼠外周血检测血常规及肝肾功能,初步评价hUCMSCs、慢病毒、IL-21及miR-200c用于裸鼠移植瘤治疗的安全性;取裸鼠外周血检测IFN-丫、TNF-α及IL-21水平;实时定量PCR法检测肿瘤组织中NKG2D、MIC A表达情况;免疫组化及Western blotting法检测肿瘤组织中β-atatenin,cycylin-D1,E-钙粘蛋白,ZEB1,Glil和Gli2表达情况。3.结果3.1构建重组质粒pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen-IL-2,经酶切及测序鉴定,结果表明重组质粒 pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen-IL-21 构建成功,命名为 pHAGE-IL-21。pHAGE-IL-21、psPAX2、pMD2. G三种质粒共转染HEK 293T细胞,24 h后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白表达,48小时后可见多量绿色荧光蛋白表达。用收获的慢病毒在24孔板内感染293T细胞,感染48h后在荧光显微镜下能够观察到荧光,慢病毒的滴度为1.0×109TU/ml,证实慢病毒包装成功,重组IL-21慢病毒和空载体慢病毒分别命名为LV-IL-21和LV-Vec。3.2成功分离培养hUCMSCs,原代培养至第三代的hUCMSCs经FCM鉴定,CD34(-)、CD45(-)、CD29 (+)、CD90 (+),符合 hUCMSCs 的细胞表型。成骨诱导培养21天时,茜素红染色可见染成橘红色的结节状或颗粒状物,呈阳性反应。成脂诱导培养21天时,油红染色提示细胞胞浆内充满红色脂肪油滴,呈阳性反应。3.3 LV-IL-21及LV-Vec分别转导传代后状态较好的hUCMSCs ,嘌呤霉素筛选,分别得到转导 LV-IL-21 的 hUCMSCs (hUCMSCs-LV-IL-21)和转导 LV-Vec 的hUCMSCs (hUCMSCs-LV-Vec)。经脾细胞增殖实验证实,hUCMSCs-LV-IL-21 表达的IL-21具有生物学活性。3.4 体外实验结果:(1) RT-PCR证实miR-200c mimic转入SKOV3中。(2) MTT法检测发现在第4、6、8天时,hUCMSCs-LV-IL-21联合miR-200c组细胞增殖速度明显下降,与其它6组比较差异有统计学意义。其余6组细胞增殖速度比较结果如下:DDP组 miR-200c组 hUCMSCs-LV-IL-21 组= hUCMSCs组= hUCMSCs-LV-Vec组对照组(“”表示结果有统计学差异(p0.05), “=”表示结果无统计学差异(p0.05) )。(3)划痕试验检测发现接种24、72h hUCMSCs-LV-IL-21联合miR-200c组细胞裂隙闭合度明显降低,与其它六组比较差异有统计学意义(p0.05)。hUCMSCs组、hUCMSCs-LV-Vec组及hUCMSCs-LV-IL-21 组细胞裂隙闭合度较对照组下降,差异有统计学意义(p0.05),而这三组间比较差异无统计学意义(p0.05)。miR-200c组裂隙闭合度低于hUCMSCs组、hUCMSCs-LV-Vec组及hUCMSCs-LV-IL-21 组(p0.05),但高于DDP组(p0.05)。(4)Transwel l小室检测发现hUCMSCs-LV-IL-21联合miR-200c组中SKOV3细胞侵袭能力明显降低,与其它六组比较差异有统计学意义(p0.05)。hUCMSCs组、hUCMSCs-LV-Vec组及hUCMSCs-LV-IL-21组细胞侵袭能力较对照组下降,差异有统计学意义(p0.05),而这三组间比较差异无统计学意义(p0.05)。miR-200c 组 SKOV3 细胞侵袭能力低于 hUCMSCs 组、hUCMSCs-LV-Vec 组及 hUCMSCs-LV-IL-21 组(p0.05),但高于DDP组(p0. 05)。3.5动物实验结果显示:(1)7个治疗组对卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用强弱依次为hUCMSCs-LV-IL-21 联合miR-200c组顺铂组 miR-200c组=hUCMSCs-LV-IL-21 组hUCMSCs组=hUCMSCs-LV-Vec组生理盐水对照组。(2)各组裸鼠的血常规指标(红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、血小板数(PLT)、白细胞总数(WBC)、中性粒细胞比例(N%))及血液生化指标(血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、甘油三脂(TG)、总胆固醇(CHOL)、乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(ALP))均无明显差异(p0.05)。 (3)治疗4周后,hUCMSCs-LV-IL-21 组及hUCMSCs-LV-IL-21 联合miR-200c组裸鼠血清中 IFN-γ、IL-21和TNF-α的含量均明显高于其它组,差异有统计学意义(*p0.05/**p 0.01)。(4)hUCMSCs-LV-IL-21 组与生理盐水对照组及hUCMSCs-LV-IL-Vec组比较,裸鼠脾细胞体外杀伤靶细胞YAC-1和SKOV3活性显著增强(P0.01)。(5)生理盐水对照组肿瘤细胞生长活跃并伴有明显核分裂象;hUCMSCs组、hUCMSCs-LV-Vec组肿瘤组织中可见单核细胞浸润,并见少量肿瘤组织出血坏死;hUCMSCs-LV-IL-21组、miR-200c组及顺铂组肿瘤组织单核细胞浸润明显,肿瘤组织出血坏死程度重于前三组;而以hUCMSCs-LV-IL-21联合miR-200c组肿瘤组织出血坏死程度最严重,并伴有大量单核细胞浸润。(6)对处死后裸鼠的肺、肝、胃及脾组织进行的常规切片HE染色病理分析,结果各组器官外观均未见异常,均未发现这些组织有卵巢癌转移征象或者肿瘤生成,病理切片显示正常。(7)免疫组化及Western blotting法检测各治疗组肿瘤组织中β-catenin、cyclin-Dl、ZEB1、E-钙粘蛋白、Glil 和Gli2表达结果显示:1) β-catenin表达:除对照组外,其它6组肿瘤组织中β-catenin的表达均有不同程度下降,其中hUCMSCs-LV-IL-21联合miR-200c组肿瘤组织中β-catenin表达明显下降,与其它各组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。2) Cyclin-D1表达:除对照组外,其它6组肿瘤组织中Cyclin-Dl的表达亦有不同程度下降,其中hUCMSCs-LV-IL-21联合miR-200c组肿瘤组织中Cyclin-D1表达下降最为显著,与其它各组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。3) ZEB1及E-钙粘蛋白表达:hUCMSCs组、hUCMSCs-LV-Vec组、hUCMSCs-LV-IL-21 组、miR-200c组、hUCMSCs-LV-IL-21联合miR-200c组均可观察到ZEB1表达减少及E-钙粘蛋白表达增加,其中hUCMSCs-LV-IL-21联合miR-200c组上述变化最明显,与其它各组比较差异均有统计学意义(P0.05)。4) Glil和Gli2表达:hUCMSCs组、hUCMSCs-LV-Vec组、hUCMSCs-LV-IL-21 组、miR-200c组、hUCMSCs-LV-IL-21 联合miR-200c组均可观察到Glil和Gli2表达减少,其中hUCMSCs-LV-IL-21联合miR-200c组上述变化最明显,与其它各组比较差异均有统计学意义(P0.05)。(8)荧光定量PCR结果提示生理盐水对照组、hUCMSCs组、hUCMSCs-LV-Vec组、miR-200c组肿瘤组织中MIC A及NKG2D表达均无明显升高,顺铂组肿瘤组织中MIC A及NKG2D表达较前述4组升高,差异有统计学意义(MIC A, p0.01; NKG2D, p0.05)。而hUCMSCs-LV-IL-21 组及 hUCMSCs-LV-IL-21 联合miR-200c 组肿瘤组织中 MIC A及NKG2D表达明显增高,与顺铂组比较差异有统计学意义(MIC A, p0.05;NKG2D,p0.01)。hUCMSCs-LV-IL-21 组与hUCMSCs-LV-IL-21 联合miR-200c组间比较,肿瘤组织中MIC A及NKG2D表达均无统计学差异(p0.05)。4.结论(1)从脐带中可成功分离培养获得hUCMSCs。携带IL-21的慢病毒可有效感染hUCMSCs。(2)慢病毒-IL-21感染的hUCMSCs能诱导IFN-γ、TNF-α分泌增加,促使NK细胞数量和活性增加,从而发挥良好的抗裸鼠卵巢癌移植瘤作用。该结果为临床使用hUCMSCs为载体的基因治疗卵巢癌研究奠定了实验基础。(3) hUCMSCs-LV-IL-21联合miR-200c在体内外均有良好的抗卵巢癌作用,其机制可能为:1) IL-21激活NK细胞,上调肿瘤组织中MIC A及NKG2D表达水平,提高裸鼠血清中IFN-γ、TNF-α含量,发挥杀伤卵巢癌细胞作用;2)hUCMSCs 及 miR-200c 下调肿瘤组织中 β-catenin、cyclin-D1、ZEB1、Glil 和Gli2表达,上调E-钙粘蛋白表达,发挥抑制卵巢癌生长与转移的作用。该研究结果为卵巢癌的治疗提供了新的策略和方法。
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【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.31

【参考文献】