花生ERF转录因子基因克隆及其在非生物胁迫下的功能研究

发布时间：2019-08-06 17:16

【摘要】：低温、干旱及高盐等非生物胁迫严重影响植物生长发育和产量。植物在遭受非生物胁迫后会产生一系列生理生化反应,建立一个系统的防御体系,这一适应过程中许多胁迫响应基因的表达受到调控。转录因子通过调控下游基因的表达,在植物非生物胁迫的基因表达调控中发挥作用。目前已证明参与植物非生物胁迫调控的转录因子包括WRKY、NAC、AP2/ERF及MYB等家族。AP2/ERF家族是植物在环境胁迫响应中重要的转录调控因子,该家族至少具有一个AP2/ERF结构域,该家族许多基因的表达受非生物胁迫的诱导。转基因研究表明,许多AP2/ERF基因在植物中过量表达能够提高转基因植株对非生物胁迫的抗性。花生是我国重要的油料作物和经济作物。低温、干旱和盐胁迫严重影响其生长发育和产量形成。目前为止,尚缺乏对花生非生物胁迫分子调控机理的深入研究。本文从花生cDNA文库中筛选并克隆到6个AP2/ERF家族基因,对这6个基因进行序列分析、组织表达模式分析、非生物胁迫下表达分析等,在此基础上构建AhERF6基因的超表达载体,并分别转化拟南芥和花生,通过对转基因植株抗性分析研究了该基因在植物非生物胁迫调控中的功能。本研究取得以下结果:1、目的基因筛选、克隆、序列分析及系统进化分析(1)利用BioEdit软件从花生cDNA文库中筛选到40个与拟南芥AtCBF1/ DREB1B(UU77378)和AtCBF3/DREB1A (AF074602)氨基酸序列中AP2/ERF结构域相似度较高的序列,表明这些序列可能编码AP2/ERF家族蛋白。(2)以“花育19号”花生品种为实验材料,通过RACE和RT-PCR克隆到6个ERF家族转录因子基因。氨基酸序列分析表明,这6个基因编码的蛋白均只包含一个单一的AP2/ERF保守结构域,属于ERF家族,将这6个基因分别命名为AhERF1、AhERF2、AhERF3、AhERF4、AhERF5和AhERF6。(3)在NCBI网站上通过Blast软件分析发现,花生中这6个ERF蛋白氨基酸序列与豆科植物的AP2/ ERF转录因子氨基酸序列具有较高的同源性,尤其是AP2/ ERF保守结构域中的序列,与拟南芥和豆科植物的DREB/CBF蛋白同源性均达到60%以上。(4)根据6个ERF家族转录因子和拟南芥ERF家族部分成员AP2/ERF保守结构域的氨基酸序列绘制了系统进化树,结果表明,AhERF2、AhERF3、AhERF5和AhERF6属于DREB/CBF亚家族,AhERF1和AhERF4属于ERF亚家族。2、6个ERF转录因子基因表达模式分析(1)通过荧光定量PCR分析了这6个ERF家族转录因子基因在花生叶片、根、茎、子叶、下胚轴和花中的表达,结果表明6个基因在花生各个组织中均有表达,但表达水平有所不同。(2)对6个基因在非生物胁迫下在花生中的表达模式进行分析,结果表明AhERF4和AhERF6在非生物胁迫下表达量快速明显的提高,AhERF1和AhERF5的表达在某些胁迫条件下只受到轻微的诱导。还有一些基因在某些胁迫下表达量有所降低:如盐胁迫花生叶片中AhERF3的表达和干旱胁迫叶片中AhERF2的表达。AhERF3和AhERF5在干旱胁迫的根和叶片中则表现出相反的表达模式。以上结果说明不同基因在花生非生物胁迫调控中可能具有不同的功能。3、AhERF6在植物非生物胁迫中的功能及分子调控机理研究(1)对AhERF6编码蛋白特性进行研究。半乳糖苷酶活性实验表明,AhERF6蛋白在酵母中具有转录激活活性;亚细胞定位分析表明,AhERF6定位于烟草叶片细胞的细胞核中,以上均符合转录因子特征。(2)将pCAMBIA1301-AhERF6超表达载体转入拟南芥中,发现转基因植株对低温和盐胁迫抗性明显增强。(3)拟南芥低温胁迫下的分子机理研究表明,逆境调控网络中关键基因RD29A、COR15A和KIN1在转基因拟南芥植株中表达量高于野生型中的表达量,拟南芥内源基因DREB1A/CBF3的表达量在转基因拟南芥植株和野生型中则没有明显差异。判断AhERF6增强转基因植株对非生物胁迫的抗性可能是通过激活DREB/CBF信号途径下游基因的表达实现的。
【图文】：

花生ERF转录因子基因克隆及其在非生物胁迫下的功能研究,张建成;2016年

３．邋１．２．１组织表达模式分析逡逑通过荧光定量ＰＣＲ检测了在花生中筛选克隆到的６个家族基因在花生叶片、逡逑根、茎、子叶、下胚轴及花中的表达（图３．３）。３；２五兄Ｆ２和在检测的６个花逡逑生组织中表达量没有明显差异，只在花中略高。在茎中表达量最高，在根中表逡逑达量最低。兄Ｆ３在叶片、根和花中的表达量比在其他组织中高，Ｊ／＾７？Ｆ５在叶片和逡逑根中的表达量高于其他组织。在花中的表达量远高于根中，约是根中表达量的逡逑６０倍。以上结果说明花生６个五家族基因在检测的６个花生组织中均有表达但表达逡逑模式不同。逡逑８０．０逦ｐ逡逑！邋｜邋Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ逡逑７０．０邋－逦？邋？逦｜0邋Ｌｅａｆ逡逑｜邋Ｒｏｏｔ逡逑＾邋６０．０逦－逦W 团邋ｓｔｅｍ逡逑５逦WW邋Ｆｌｏｗｅｒ逡逑0邋５０．０逦—逦W 题邋Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ逡逑Ｚ逦W逡逑＾邋４０．０逦－逦＿逡逑＇Ｉ邋３０．０邋－逦＾逦ｒ＊ＴＴ逦W逡逑１逦ｌｌ邋１逡逑２０．０逦－邋ｐ逦■W邋＿逡逑0．0邋ｒＵｉ■S茫樱琎i一逡逑ＡｈＥＲＦＩ逦ＡｈＥＲＦ２逦ＡｈＥＲＦ３逦ＡｈＥＲＦ４逦ＡｈＥＲＦ５逦ＡｈＥＲＦ６逡逑图３．３６个基因在花生叶片、根、茎、花、子叶及下胚轴中的组织表达模式分析逡逑叶片、根、茎、子叶及下胚轴均取自三叶期花生幼苗，花取自盛花期花组织。价为内参基因。数据为三次重复逡逑的平均值，误差线表示标准误差ＳＤ。逡逑Ｆｉｇ３．３邋Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＡｈＥＲＦｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｌｅａｖｅｓ

花生ERF转录因子基因克隆及其在非生物胁迫下的功能研究,张建成;2016年

３．１．２．邋４盐胁迫下的表达模式分析逡逑为进一步了解这６个幻？Ｆ家族转录因子基因在花生非生物胁迫中的功能，通过荧光逡逑定量ＰＣＲ检测了６个基因盐胁迫下在花生叶片和根中的表达（图３．７，３．８）。从图中可逡逑以看出兄Ｆ７在花生根和叶片中在盐胁迫下表达均略有提高，在处理３邋ｈ后达到最高逡逑（图３．７ａ，３．８ａ）。的表达没有明显规律，，只在盐处理１２邋ｈ的花生叶片中（图逡逑３．７ｂ）和２４ｈ的根中（图３．８ｂ）表达略有下降。和在花生叶片和根中呈逡逑现不同的盐胁迫响应模式：盐胁迫下，在根中的表达没有明显变化（图３．８ｃ），逡逑但在叶片中快速下降（图３．７ｃ）；盐胁迫下在叶片中表达量不变（图３．７ｄ），逡逑在根中则受盐胁迫快速诱导，盐处理３邋ｈ表达量到最高，上调倍数近１５０倍（图３．８ｄ）。逡逑３７逡逑
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S565.2;Q943.2

【参考文献】