CRISPR-Cas9介导BSP基因编辑对乳腺癌细胞生物学性质的影响

发布时间：2019-08-08 11:40

【摘要】：CRISPR-Cas9系统是原核生物抵御病毒或质粒等外来遗传物质入侵的一种获得性免疫系统,主要由非特异性Cas9核酸酶和起识别作用的crRNA组成。该系统自2012年首次证明可以在体外对DNA进行基因编辑,现已成功地应用于不同物种的基因编辑中。作为一种新型的基因编辑技术,该技术具有简单、快速、高效等优点。目前该技术已成功的应用于多种物种的基因敲除、gRNA文库的建立及动物疾病模型的构建等。骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)是骨基质中一种高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白,在肿瘤的粘附、增殖、侵袭、基质降解、免疫反应(炎症和补体逃逸)、血管生成等转移相关的多个过程中发挥重要作用。自1994年Bellahcene首次证实BSP表达与乳腺癌骨转移相关,有关乳腺癌骨转移与BSP的关系研究取得了明显进展。目前相关研究报道中抑制BSP表达的方法包括反义核酸、BSP抗体及RNA干扰技术,但都只是在转录后或翻译水平不同程度地暂时降低BSP的表达。因此,本研究拟利用CRISPR-Cas9技术,在转录水平抑制亲骨转移乳腺癌细胞(231BO)的BSP基因表达,通过细胞增殖、克隆形成和细胞划痕实验初步检测细胞生物学性质变化,为进一步研究BSP与乳腺癌骨转移关系的分子机制提供实验依据。本实验的主要研究结果如下:1.成功构建表达Cas9蛋白的亲骨转移乳腺癌细胞(231BO-Cas9)。通过流式细胞术、Western blot、免疫细胞化学检测证实231BO-Cas9细胞表达Cas9蛋白,并且在核定位信号的引导下能够进入到细胞核中。2.实时无标记动态细胞分析和划痕实验结果表明Cas9蛋白的表达对乳腺癌细胞的增殖和迁移均无影响;电镜观察发现231BO-Cas9与231BO细胞的细胞膜、细胞器及细胞核的结构一致,提示Cas9蛋白表达对乳腺癌细胞超微结构无影响。3.SURVEYOR检测和基因测序结果表明针对BSP的gRNA能够介导Cas9蛋白对靶位点进行切割,造成BSP基因的插入缺失突变,提示231BO-Cas9细胞表达的Cas9蛋白能够进入到细胞核中并发挥核酸内切酶的作用。4.利用CRISPR-Cas9技术获得2株BSP蛋白表达下降乳腺癌细胞株(231BO-Cas9-gRNA)。与对照组细胞相比,western blot结果显示2株231BO-Cas9-gRNA细胞BSP表达下降分别为34.5%和36.7%;通过CCK-8检测发现231BO-Cas9-gRNA细胞增殖能力下降,细胞划痕实验提示231BO-Cas9-gRNA细胞的愈合速度分别降低28%和32.9%;克隆形成实验显示231BO-Cas9-gRNA细胞的克隆形成能力分别降低32.3%和37.2%。实验结果表明CRISPR-Cas9介导BSP基因编辑引起BSP蛋白表达水平下调后,亲骨转移乳腺癌细胞的增殖、迁移及克隆形成能力均有所下降。
【图文】：

第一章 绪论、加工与成熟：CRISPR 重复序列和间隔序列一同经转录加工为 pre-crRNRNA 的重复序列区域与 tracrRNAs 配对杂交，接着由内源性的 RNase Ⅲ从列的 5’端裂解杂合的 pre-crRNA-tracrRNAs，产生成熟的 tracrRNA-crRNAs9 核酸内切酶结合[17]；最后，当同样的外源 DNA 再次入侵时，CRISPR-C双链 DNA 的靶位点结合并进行切割，从而破坏外来入侵 DNA。靶 DNA的断裂既需要靶序列和间隔序列之间的互补，又必需靶 DNA 序列的 3’端序列（Protospacer adjacent motif）[18]，PAM 序列的存在同时还避免了 CRI被作为靶标识别，提供了一个区别“异己”和“自己”的机制。不同来源的 有不同的PAM序列，最常用的基于产脓链球菌CRISPR系统的PAM序列为任意核苷酸[17]。

第一章 绪论生的作用[26]。并且，dCas9 还可以通过融合各种效应因子结合在特异的基因位点上挥不同的作用。例如，有研究[28-32]将转录激活子或转录抑制子融合在 dCas9，可以定基因的表达进行调节（图 1-2A），并且通过多个 gRNA 介导多个不同的转录因子在同一基因位点，有效地提高了基因调节的效率，推测其与转录因子之间的协同作关[15, 28, 29, 32]。也有研究通过 dCas9 融合 eGFP 蛋白来判断一段基因序列中是否包含复序列，，例如端粒[33]（图 1-2B），gRNA 可特异性识别重复序列，若 DNA 位点包重复序列，则会通过 dCas9 结合多个 EGFP 蛋白，该策略为研究染色体的结构和动提供了一种有效的方法，并且使 CRISPR-Cas9 系统的应用不仅仅局限于基因编辑的。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9;Q78

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 谢漪;;辐射对乳腺癌细胞的影响及分子机理(英文)[J];IMP & HIRFL Annual Report;2011年00期

2 张丽军;谭丁桃;;乳腺癌蛋白质组研究进展[J];生命科学;2007年05期

3 ;国内新闻[J];科技导报;2008年01期

4 张艳君;李席如;郭洪霞;刘梅;吕亚丽;;乳腺癌血管内皮生长因子-C和微血管密度的表达及其意义[J];科技导报;2008年09期

5 ;日科学家找到可抑制乳腺癌的酶[J];中国科技信息;2009年04期

6 黄世梅;胡争青;;乳腺癌的高频超声诊断分析[J];井冈山学院学报;2009年03期

7 谢秋玲;卢加;刘兰;张传宇;郭欣泳;彭雯丹;陈小佳;;乳腺癌细胞中人血小板衍生生长因子受体β启动子的基础活性研究[J];中国生物工程杂志;2011年04期

8 李婉津;桂宾;;科学家发现代谢异常与乳腺癌发病关联的分子机制[J];中国生物化学与分子生物学报;2013年04期

9 卢山;龚朝辉;王琳;徐进;季林丹;;非编码RNA与乳腺癌的研究进展[J];中国细胞生物学学报;2013年06期

10 杜善梅;;微小RNA及其在乳腺癌发生发展中的作用[J];内江科技;2013年11期

相关会议论文 前10条

1 于永利;;抗乳腺癌免疫治疗融合蛋白[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

2 郭红飞;;中医治疗乳腺癌的策略[A];江西省中医、中西医结合肿瘤学术交流会论文集[C];2012年

3 庞朋沙;伍会健;;乳腺癌治疗靶标的研究进展[A];北方遗传资源的保护与利用研讨会论文汇编[C];2010年

4 陆劲松;邵志敏;吴炅;韩企夏;沈镇宙;;新型维甲酸抑制乳腺癌细胞的生长及诱导凋亡的机制研究[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

5 刘爱国;胡冰;;乳腺癌临床治疗进展[A];安徽省抗癌协会第四次代表大会暨乳腺癌、肺癌专业委员会成立会议、安徽省肿瘤防治进展学术研讨会论文汇编[C];2001年

6 张嘉庆;王殊;乔新民;;乳腺癌的现状和远景[A];第一届全国中西医结合乳腺疾病学术会议论文汇编[C];2002年

7 刘清俊;;乳腺癌综合治疗的新进展[A];山西省抗癌协会第六届肿瘤学术交流会论文汇编[C];2003年

8 邵志敏;;21世纪乳腺癌治疗的展望[A];第三届中国肿瘤学术大会教育论文集[C];2004年

9 陈松旺;张明;;乳腺癌治疗的回顾与展望[A];西部地区肿瘤学学术会议论文汇编[C];2004年

10 白霞;傅建新;丁凯阳;王兆钺;阮长耿;;组织因子途径抑制物-2在乳腺癌细胞中的表达研究[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

相关重要报纸文章 前10条

1 ;血检有望揭示乳腺癌治疗效果[N];医药经济报;2004年

2 记者 郑晓春;乳腺癌细胞扩散基因被找到[N];科技日报;2007年

3 中国军事医学科学院肿瘤中心主任 宋三泰;乳腺癌有了新疗法[N];中国妇女报;2002年

4 王艳红;抑制ＤＮＡ修补可消灭乳腺癌细胞[N];医药经济报;2005年

5 詹建;乳腺癌饮食 两个时期不一样[N];中国中医药报;2006年

6 辛君;乳腺癌扩散基因“浮出水面”[N];大众卫生报;2009年

7 记者 毛黎;美发现有效抑制乳腺癌细胞生长的分子[N];科技日报;2010年

8 记者 吴春燕　通讯员 王丽霞;乳腺癌治疗将有新途径[N];光明日报;2011年

9 王乐　沈基飞;我科学家发现导致乳腺癌耐药的新标志物[N];科技日报;2011年

10 刘霞;一种天然分子能阻止乳腺癌恶化[N];科技日报;2011年

相关博士学位论文 前10条

1 柴红燕;疾病状态下CYP4Z1和4A的生物学行为及其药物干预研究[D];武汉大学;2012年

2 李凯;ID(inhibitor of DNA binding)家族蛋白调控乳腺细胞的分化并影响乳腺癌的预后[D];复旦大学;2014年

3 江一舟;乳腺癌新辅助化疗前后基因变异检测及其功能论证[D];复旦大学;2014年

4 马邵;酪氨酸去磷酸化增强表皮生长因子受体在乳腺癌治疗中靶向性的研究[D];山东大学;2015年

5 姚若斯;精氨酸甲基转移酶PRMT7诱导乳腺癌细胞发生表皮—间质转换及转移的作用机制研究[D];东北师范大学;2015年

6 侯培锋;α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)上调缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)诱发高致瘤性干细胞样乳腺癌细胞机制研究[D];福建医科大学;2014年

7 李丽丽;分泌蛋白SHON调控乳腺癌细胞EMT的分子机制研究[D];东北师范大学;2015年

8 陈丽艳;PI3K抑制剂联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂对乳腺癌协同杀伤作用的分子机制研究[D];延边大学;2015年

9 朴俊杰;乳腺癌差异基因筛选及PAIP1对其生物学行为的影响[D];延边大学;2015年

10 汪[?如;染色体6q25.1区域基因多态性与乳腺癌遗传易感性的关联研究[D];南方医科大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 杜文英;乳腺癌分子亚型的临床与病理特点[D];郑州大学;2011年

2 贾晓菲;彩色多普勒超声与乳腺癌病理及免疫组化指标的相关性研究[D];内蒙古大学;2015年

3 靳文;乳腺癌全基因组DNA甲基化修饰的研究[D];内蒙古大学;2015年

4 吴坤琳;TLR4/MyD88信号通路对乳腺癌侵袭性影响的实验研究[D];福建医科大学;2015年

5 葛广哲;树

本文编号：2524343