木本曼陀罗托品酮还原酶Ⅰ基因克隆及功能验证

发布时间：2019-08-08 09:26

【摘要】：托品烷类生物碱(Tropane alkaloids,TAs)主要提取自茄科植物,包括莨菪碱(hyoscyamine)、山莨菪碱(anisodamine)和东莨菪碱(scopolamine),而莨菪碱和东莨菪碱是两种作为抗胆碱药物而被广泛应用于副交感神经系统,因而临床上常应用于镇痛、麻醉、抗晕动药、治疗帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、治疗农药中毒等。山莨菪碱作为非特异性胆碱受体拮抗剂,其药理性与莨菪碱相似,然而东莨菪碱与莨菪碱相比较,其在临床上具有药效更强而副作用更小的特点,因而具有更大的市场价值。但是在茄科植物中东莨菪碱的含量极低,而利用人工合成的方法其成本太高且困难,因而在茄科植物中,通过代谢工程以获得高产东莨菪碱的药用植物将成为我们研究的一个方向。木本曼陀罗(Brugmansia arborea)属于茄科(solananaceac)曼陀罗属(Datura)的植物,根据前人报道的文献可知,木本曼陀罗的东莨菪碱含量极高,其化学型属于东莨菪碱型,因而我们以此为研究材料,通过同源物种(Datura stramonium和Datura innoxia)的托品酮还原酶Ⅰ(tropinone reductase I,TRI)基因序列比对,并分析保守区域的基因序列,利用RACE的方法,从B.arborea中克隆而获到一条TRI序列,BaTRI全长序列为1138-bp,包括41-bp的5’UTR、278-bp的3’UTR和819-bp的开放性阅读框(Open Reading Frame,ORF),该编码区能编码272个氨基酸,通过与其它已知的TRI氨基酸序列进行比对分析后,该氨基酸序列具有TRI功能必需的的结构域;通过体外重组技术,并在Rosstar中高效表达BaTRI,能纯化出大小约为30kDa的重组蛋白,与预测的29.7kDa相一致,同时为了与已经报道的DsTRI进行比较,我们从D.stramonium中克隆并获得编码DsTRI基因序列;对重组BaTRI酶动力学参数进行测定,其结果显示:以托品酮作为测定底物时,BaTRI的高还原活性能维持在一个很宽的pH范围(从6.8-8.0),而在8.0时活性最高,当以托品作为测定底物时,BaTRI的高氧化活性只能维持在一个很小的pH范围,而在9.6时活性最高。我们以6.4(植物的生理活性pH)作为酶动力学测定值,BaTRI对托品酮底物的Km、Vmax和Kcat分别为2.65 mM、88.30 nkat.mg-1和2.93 S-1,同时,也对两种托品酮的底物类似物进行了测定:4-甲基环己酮(4-methylcyclohexanone)和3-奎宁环酮盐酸盐(3-quinuclidinone hydrochloride),它们分别为单列酮和双环酮的典型底物,常被用于托品酮还原酶的鉴定。此外,在9.6时还测定了BaTRI对托品的相关酶动力学参数,其Km、Vmax和Kcat分别为0.56 mM、171.62 nkat.mg-1和0.54 S-1,结果显示BaTRI对托品的Km小于BaTRI对托品酮Km,但是两个反应的pH不一样,BaTRI对托品酮的反应处在弱酸性而BaTRI对托品的反应却处在强碱性,当在弱酸性范围时BaTRI对托品反应极低,而植物的生理PH为6.4,说明在B.arborea体内主要是还原反应占主导优势。为了与DsTRI进行酶活性比较,相同条件下,测定了DsTRI对托品酮底物的Km、Vmax和Kcat,它们的值分别为4.18 mM、81.20 nkat.mg-1和2.40 S-1,测定的结果显示BaTRI的Km小于DsTRI的Km,说明BaTRI对托品酮的亲和力更高,为了更好的说明BaTRI还原活性高于DsTRI,在6.4、6.8和7.0时同时测定了BaTRI和DsTRI对5mM托品酮的Kcat,结果显示BaTRI在6.4、6.8和7.0时对5mM托品酮的Kcat都高于DsTRI的Kcat,说明BaTRI对托品酮的催化效率更高,从而显示BaTRI的活性高于DsTRI;利用qPCR方法研究BaTRI在各组织中的表达情况,结果显示,BaTRI在各组织中都有表达,而在须根中的表达量最高,其表达模式与之前我们实验组所报道的BaH6H表达模式相一致,但是与所报道的几个草本物种的表达模式有很大区别;利用HPLC分析各组织中TAs的含量,结果显示,B.arborea主要含有东莨菪碱,而叶片和茎枝中的含量高于其他部位,说明B.arborea与D.stramonium和Hyoscyamus Niger一样,其化学型属于东莨菪碱型植物。BaTRI的表达模式和TAs的含量分布说明,在B.arborea中,地下部分是TAs合成的主要场所,地上部分也同时参与了TAs的合成。本文通过对BaTRI功能验证的研究,可以确定木本曼陀罗托品酮还原酶I的活性很高,为我们以后对TAs合成途径上的TRI靶位点进行改造时,提供一个更高效的候选基因,以便能得到高产东莨菪碱的药用植物。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

【参考文献】

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1 龙世平;卢衍;王亚雄;杨春贤;兰小中;廖志华;;过表达内源PMT和H6H基因对颠茄发根托品烷类生物碱合成的影响[J];药学学报;2013年02期

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本文编号：2524288