里氏木霉VPS13基因缺失对菌丝分支、生孢和纤维素酶产量的影响

发布时间：2019-08-19 10:35

【摘要】：【目的】丝状真菌里氏木霉是纤维素酶生产的主要工业真菌。纤维素酶分泌过程中的蛋白运输途径是控制大量纤维素酶成功输出的重要环节,因此,研究蛋白分泌途径的特定靶标基因功能将有助于鉴定纤维素酶运输分泌过程的关键调控因子。本研究借助基因敲除方法将里氏木霉液泡蛋白分选相关基因VPS13缺失,分析了该基因缺失对菌株生长、生孢尤其是纤维素酶分泌的影响。【方法】利用Double-joint PCR技术和同源重组策略构建里氏木霉VPS13基因缺失突变株,通过菌丝培养、显微观察、生孢检测、蛋白与酶活测定,系统比较VPS13基因敲除前后菌株的生长特征、菌丝形态、孢子形成、蛋白分泌以及纤维素酶活等。【结果】成功获得两株VPS13基因缺失株。与出发菌株相比,该基因突变后菌丝蔓延速率明显减慢,但菌体生物量在对数生长期后显著增多。通过显微观察,发现该基因缺失株菌丝更加密集,分支明显增多。此外,该基因缺失也导致菌株生孢延迟。纤维素底物平板分析发现VPS13基因缺失株菌落周围透明圈更加清晰,且透明圈圈径比是出发菌株的4倍,说明降解纤维素的能力有明显提高。进一步的液体发酵实验结果显示,该基因缺失导致蛋白产量及纤维素酶活力分别提高16.4%和21.9%。【结论】里氏木霉VPS13基因在菌丝生长、生孢、蛋白分泌等不同生物学过程中具有功能多样性,且该基因在菌种改良上可以作为提高纤维素酶产量的重要靶点。
【图文】：

示意图,里氏木霉

死愱PS13A蛋白进行结构域分析，，结果发现VPS13蛋白均含有3个功能保守的结构域：Chorein_N(Chorein或者VPS13N端区域；pfam12624)、SHR-BD(液泡分选相关蛋白13SHR结合区域；pfam06650)和ATG_C(自噬相关蛋白C端结构域；pfam09333)(图1-B)。综上，VPS13基因在真核生物中是高度保守的，且该基因在真核细胞中可能具有重要功能。2.2里氏木霉VPS13菌株构建及PCR和Southernblot验证参照Double-jointPCR融合技术[16]，将U-VPS13、pyrG、D-VPS13进行3片段融合，使用巢式引物P1/P7扩增得到敲除盒，构建示意图如图2-A。图1.里氏木霉VPS13蛋白鉴定Figure1.IdentificationofT.reeseiVPS13protein.A:phylogeneticanalysesofVPS13proteinswereperformedusingNeighbourJoiningfromT.reesei(XP_006967068),C.platani(KKF96583),H.marmoreus(KYQ45681),K.phaffii(CCA36675),S.cerevisiae(CAA97491),D.melanogaster(NP_610299)andH.sapiensVPS13A(Q96RL7).Numbersindicatethebootstrapvalue.Thebarmarkerindicatesthegeneticdistance,whichisproportionaltothenumberofaminoacidsubstitutions.B:domainanalysisofVPS13proteinsshowsrelativelyhigherlevelofhomologyintheChorein_N,SHR-BDandATG_CfromT.reesei(XP_006967068),S.cerevisiae(CAA97491),andH.sapiensVPS13A(Q96RL7).分别以里氏木霉QP4基因组DNA和pAB4-1质粒DNA为模板，扩增得到的1.90、1.80和2.75kb的VPS13上下游同源臂和pyrG基因片段经融合PCR得到6.45kb的VPS13敲除盒。然后采用CaCl2-PEG介导的原生质体法转化里氏木霉QP4，挑取转化子进行传代和分纯。通过PCR及Southernblot验证，成功获得2株验证正确的VPS13基因缺失株，将其命名为VPS13-1和

里氏木霉,基因缺失,菌株

1560RuiyanLiuetal.|ActaMicrobiologicaSinica,2017,57(10)actamicro@im.ac.cnVPS13-2。验证结果显示，VPS13转化子中可以扩增得到敲除盒pyrG编码区内部基因0.79kb(图2-B)、染色体上游锚定片段2.38kb(图2-C)和染色体下游锚定片段2.08kb左右的条带(图2-D)，而出发菌株QP4染色体和阴性对照H2O为模板时没有扩展出目的片段条带，与预期结果符合。这表明VPS13敲除盒已经发生同源交换，成功插入里氏木霉QP4染色体中。进而使用VPS13基因内部引物(P13/P14)扩增0.91kb片段，VPS13转化子和H2O没有目的条带，QP4能扩增出0.91kb的目的带(图2-E)，说明里氏木霉VPS13在染色体水平已经被定点敲除。为了进一步确认VPS13基因敲图2.里氏木霉VPS13基因缺失菌株构建及PCR和Southernblot验证Figure2.ConstructionofVPS13deletioninT.reeseiandidentificationofthemutantsbyPCRandSouthernblot.A:schematicrepresentationofthedeletionofVPS13;B-E:confirmationofVPS13deletionbyPCRamplification;F:confirmationofVPS13deletionbySouthernblot.M:1kbladderDNAmarker;1:PCRproductwithH2Oastemplate;2 4:productsofPCRorSouthernblotwiththegenomicDNAofQP4,VPS13-1andVPS13-2,respectively.
【作者单位】：齐鲁工业大学生物工程学院;山东大学生命科学学院微生物技术国家重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金(31370135) 山东大学基本科研业务费专项资金(2015JC005) 山东省农业科技成果转化资金(2014-45)~~
【分类号】：Q93

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