番茄胞嘧啶甲基转移酶同源基因SlMET1功能研究

发布时间：2019-08-19 11:48

【摘要】：真核生物中,DNA甲基化作为表观遗传学修饰的重要手段之一,影响了植物的大量生长发育过程。文章通过生物信息学分析确定番茄中的胞嘧啶甲基转移酶同源基因(SlMET1)并对其进行进化关系的分析;利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术从番茄cDNA中扩增出胞嘧啶甲基转移酶同源基因(SlMET1)全长,构建SlMET1与绿色荧光蛋白融合表达载体,通过在烟草瞬时表达系统,对其进行亚细胞定位;实时定量PCR分析SlMET1基因在番茄不同组织中的表达模式;同时,构建SlMET1与HA标签蛋白融合表达载体,通过免疫共沉淀分析其与DDB1的相互关系。研究结果表明:SlMET1基因在番茄各个时期和组织中都有表达,其中,叶片和花中表达量较高,在果实的变色期和红果时期表达量较低;通过绿色荧光融合蛋白载体的表达,确定SlMET1基因只在番茄细胞核中表达;通过免疫共沉淀分析确定SlMET1和DDB1之间存在相互作用。该研究为研究DDB1以表观遗传学的方式调控植物生长发育过程奠定了理论基础。
【图文】：

序列,生物信息学分析,番茄

心１０ｍｉｎ，吸取上清液于一新ＥＰ管中；测定蛋白质量浓度，以等量的蛋白量加入等量标签抗体；４℃旋转结合２ｈ；加入ＰｒｏｔｅｉｎＧ亲和层析珠子，４℃旋转结合１ｈ；用裂解液冲洗珠子３次；加入ＳＤＳ上样缓冲液，煮沸５ｍｉｎ；离心后取上清进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，转膜并分别用ＨＡ和Ｆｌａｇ抗体进行显影。２结果与分析２．１ＳｌＭＥＴ１基因的生物信息学分析结果本文根据已公布的番茄ＳｌＭＥＴ１序列，对其可能的功能结构域进行分析，结果如图１所示。图１番茄ＳｌＭＥＴ１基因的生物信息学分析ＳｌＭＥＴ１由５个功能结构域组成，分别为２个胞嘧啶甲基转移酶结构域（ＤＮＭＴ－ＲＦＤ）、２个与ＤＮＡ甲基化相关的ＢＡＨ结构域和１个胞嘧啶甲基化酶结构域（ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｓｅ），由此可推断，本文的ＳｌＭＥＴ１为番茄中与ＤＮＡ甲基化相关的甲基转移酶（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。结合ＧｅｎＢａｎｋ中已公布的包括拟南芥、甜橙、胡萝卜、巨桉、烟草、胡杨、蓖麻、芝麻、可可、葡萄等在内的植物相应序列，使用ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８和ＭＥＧＡ５．０软件，，依据邻位相连法构建进化树。结果显示番茄ＭＥＴ１与烟草的亲缘关系最近，与拟南芥最远。２．２ＳｌＭＥＴ１基因扩增及测序分析以野生型番茄ｃＤＮＡ为模板，ＳｌＭＥＴ１－Ｆ和ＳｌＭＥＴ１－Ｒ为引物进行ＰＣＲ扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图１所示，由图１可知，所得特异性基因片段的大小与预期的ＳｌＭＥＴ１基因一致。通过测序比对证实，该基因片段即为番茄

番茄,基因,野生型,变色期

ｔａｌＸ１．８和ＭＥＧＡ５．０软件，依据邻位相连法构建进化树。结果显示番茄ＭＥＴ１与烟草的亲缘关系最近，与拟南芥最远。２．２ＳｌＭＥＴ１基因扩增及测序分析以野生型番茄ｃＤＮＡ为模板，ＳｌＭＥＴ１－Ｆ和ＳｌＭＥＴ１－Ｒ为引物进行ＰＣＲ扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图１所示，由图１可知，所得特异性基因片段的大小与预期的ＳｌＭＥＴ１基因一致。通过测序比对证实，该基因片段即为番茄中的ＳｌＭＥＴ１基因。Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００图２ＳｌＭＥＴ１基因的ＰＣＲ扩增２．３绿色荧光蛋白及植物表达载体鉴定利用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ双酶切ｐＢ－ＴＥＸ－ＳｌＭＥＴ１－ＨＡ，另外利用ＫｐｎⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ｐＡＲＴ２７－ＳｌＭＥＴ１－ＧＦＰ表达载体，得到预期大小的ＳｌＭＥＴ１基因片段，如图３所示。从而确定ＳｌＭＥＴ１基因已经连接到载体ｐＢＴＥＸ和ｐＡＲＴ２７－ＧＦＰ中。１．ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ双酶切２．ＫｐｍⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切图３ｐＢＴＥＸ－ＳｌＭＥＴ１载体和ＰＡＲＴ２７－ＳｌＭＥＴ１－ＧＦＰ酶切鉴定图２．４ＳｌＭＥＴ１基因表达模式分析提取野生型番茄的各个组织（根、茎、叶、花）和不同发育时期的果皮（授粉后１４、３５ｄ、变色期和成熟期）中的总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ后，用实时定量ＰＣＲ的方法测定不同组织中ＳｌＭＥＴ１８３２合肥工业大学学报（自然科学版）第４０卷
【作者单位】：合肥工业大学食品科学与工程学院;
【基金】：国家自然科学基金资助项目(31471157)
【分类号】：Q943.2

【参考文献】