最适pH降低的中性蛋白酶Ⅰ基因在米曲霉中的表达

发布时间：2019-08-28 11:20

【摘要】：米曲霉(Aspergillus oyzae)能够分泌高活力的酶,因而被长时间应用在传统发酵食品的生产中。米曲霉中性蛋白酶(neutral protease)的分解作用将原料中的蛋白质发酵水解成多种氨基酸。本研究以米曲霉中性蛋白酶I(NPI)作为对象,分析糖基化对蛋白酶活力的影响,并进一步构建食品级高活力的中性蛋白酶基因米曲霉工程菌。主要研究内容如下:1对中性蛋白酶进行三维结构模拟,分析发生突变的位置,发现糖基化位点都发生在蛋白酶表面。利用定点突变技术获得了表达载体p PIC9K-NPI-P56Y-6His和p PIC9K-NPI-N41AP56Y-6His,转入毕赤酵母Gs115。利用BMGY/BMMY培养基诱导蛋白表达,分别在60 h和72 h达到最大酶活42 U/m L和60 U/m L。对表达的蛋白酶进行硫酸铵沉淀和镍柱纯化,SDS-PAGE分析得蛋白分子量大小分别为70 KDa和50 KDa左右。对中性蛋白酶的活力进行测定:r NPI的酶活为217U/mg,r NPI-P56Y的酶活为242 U/mg,r NPI-N41AP56Y的酶活为147 U/mg。2以尿嘧啶依赖的米曲霉工程菌AS11为出发菌株,以0.8 M Na Cl溶液作为渗透压缓冲液制备米曲霉原生质体,原生质体浓度达到8.5×106个/m L,再生率为22%。构建了打靶载体p NP-NPI-6His、p NP-NPI-Y122FK246ID382V-6His和p NP-NPI-Y122FK246ID382VY186S-6His。转化米曲霉原生质体。三株转化子分别命名为:米曲霉D(p NP-NPI-6His)、米曲霉E(p NP-NPI-Y122FK246ID382V-6His)和米曲霉F(p NP-NPI-Y122FK246ID382V-Y186S-6His)。米曲霉AS11的酶活为3100.36U/g;米曲霉B的酶活为2290.81 U/g;米曲霉D、E、F的酶活分别为3978.41 U/g、4435.62 U/g和3540.27 U/g。
【图文】：

[28]。图1-1 原生质体化学转化[28]Fig 1-1 Chemical transformation of protoplast1.4.2 转化子的筛选转化产物中存在大量的未转化的原生质体，必须依赖选择性的标记才能从其

第二章 米曲霉重组中性蛋白酶的糖基化对酶活的影响的构建因 NPI-P56Y 和 NPI-N41AP56Y 的获取组 NPI 糖基化对中性蛋白酶活力的影响，采用不同的模化位点和改变糖基化位点的重叠延伸 PCR，使成熟肽氨酸脯氨酸突变为酪氨酸，以达到在 56 位处增加糖基化识 所示的是两轮 PCR 产物的凝胶电泳分析，A 片段大小为小为 1000bp 左右，，基因全长为 1900bp 左右，从图中可以的基因大小相符。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q936

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本文编号：2530120