家蚕细胞凋亡抑制因子BmAPI5基因克隆与功能研究

发布时间：2019-09-05 09:48

【摘要】：细胞凋亡在生物体的生命活动中扮演着重要角色,其过程受到众多基因调控。其中,API5(Apoptosis inhibitor-5)是一种新发现的细胞凋亡抑制因子,能有效阻断细胞凋亡进程,但其结构与已知的细胞凋亡抑制蛋白(Inhibitors of apoptosis,IAPs)并不相同。目前有关API5的研究主要集中在人类癌症相关等方面,因其高水平表达可促进癌细胞发生而倍受关注。通过基因序列的比对分析,在家蚕(Bombyx mori)基因组中发现存在该蛋白的同源基因BmAPI5(Gen Bank编号:XM_004927989),但其在家蚕体内的功能与作用至今尚未见有报道。本文从家蚕中克隆获得BmAPI5基因全长c DNA序列,并在对该基因及其蛋白序列作生物信息学分析的基础上,开展基因的时空表达分析以及对家蚕细胞凋亡的影响等研究,获得主要结果如下:1.家蚕BmAPI5基因克隆与表达克隆获得家蚕BmAPI5基因全长c DNA序列,其开放阅读框长1,671 bp,编码557个氨基酸残基,蛋白分子量63.13 k D,等电点6.09。BmAPI5蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,具有Lxx LL基序和亮氨酸拉链等特征结构域。家蚕BmAPI5与黑腹果蝇和人类同源基因Aac11的氨基酸序列相似性分别为46%和47%。将家蚕BmAPI5开放阅读框序列克隆至原核表达载体p ET-32a中,经大肠杆菌(Escherichia coli)诱导表达获得重组BmAPI5蛋白,并制备其兔多克隆抗体。2.家蚕BmAPI5基因时空表达分别采用实时荧光定量PCR技术和Western杂交技术分析家蚕BmAPI5基因在不同发育时期、不同组织以及微生物感染后的转录与表达水平。BmAPI5基因在家蚕卵、幼虫和蛹中均有不同程度的转录和表达,其中以5龄幼虫的转录水平显著为高。在不同组织中,BmAPI5以脂肪体中的转录和表达水平显著较高。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)和大肠杆菌侵染均能快速显著诱导BmAPI5基因的转录与表达,其中以Bm NPV的诱导作用较为明显。这表明BmAPI5可能参与Bm NPV-宿主的互作机制。3.家蚕BmAPI5对细胞凋亡的影响在家蚕Bm N细胞中分别构建BmAPI5过表达和抑制表达体系的基础上,分别采用流式细胞技术和Caspase活性检测技术分析BmAPI5表达变化对家蚕细胞凋亡的影响。流式细胞仪检测结果表明,在家蚕Bm N细胞中过量表达BmAPI5基因可显著降低经PBS饥饿诱导的细胞凋亡水平;而抑制表达该基因则可导致PBS饥饿诱导的细胞凋亡水平显著较高。对不同处理的Caspase活性检测结果与流式细胞仪检测结果一致。这表明BmAPI5具有抑制细胞凋亡的功能。本文研究结果不仅可为进一步研究BmAPI5调控细胞凋亡的分子机制提供基础,还能为探明BmAPI5在家蚕-杆状病毒互作中的功能作用以及用于家蚕抗病毒防治提供新思路。
【图文】：

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3.1 家蚕 BmAPI5 的 RT-PCR 产物分ig. 3.1 RT-PCR product analysis of BmAA 蛋白分子量标准; 1: BmAPI5 PCR 扩NA Ladder; 1: BmAPI5 amplified bands o息学分析放阅读框全长 1,671bp，编码 557 个图 3.2）。

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浙江理工大学硕士学位论文家蚕细胞凋亡抑制因子 BmAPI5 基因克隆与功能研利用 ProtScale 软件对 BmAPI5 进行疏水性分析，，发现其 N 端和 C 端具有较强的亲水性（图 3.3）。
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S881.2;Q78

【参考文献】