形成素样基因2通过Rho GTPases信号通路调控基质金属酶2在肝癌细胞中的表达

发布时间：2019-09-10 17:20

【摘要】：原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,发病率、复发转移率高,死亡率高,预后不理想。因此,肝癌的早期发现、早期诊断和预防复发,对于临床治疗和预后有非常重要的意义。形成素样蛋白(FMNL-2)和基质金属酶(MMP-2)都参与了原发性肝癌的侵袭转移机制。FMNL-2可以调控肌动蛋白骨架的结构改变以及伪足运动。MMP-2通过酶解细胞外基质及基底膜蛋白胶原,与肿瘤细胞突破基底膜屏障密切相关。研究表明,FMNL-2导致肿瘤细胞迁移是通过Rho相关信号通路实现的。细胞迁移过程中FMNL-2参与Rho相关蛋白Cdc42板状伪足的延长。另有研究表明,原发性肝癌细胞中Rock2调控MMP2对其侵袭迁移的作用。本实验组前期实验已经证明FMNL-2对MMP-2存在调控关系,本实验通过基因沉默技术下调FMNL-2,以及Y27632阻断Rho GTPases时,分别检测Rho A、Racl、Cdc42、MMP-2蛋白的变化以及m RNA的变化,从而判断FMNL-2调控MMP-2是否通过Rho GTP酶通路。为以Rho信号通路为靶标的抗肿瘤药物的研发提供理论依据。目的:确认FMNL-2和MMP-2之间的关系,明确FMNL-2是否通过Rho GTPases途径调控MMP-2。方法:1、应用基因沉默技术构建FMNL-2低表达的肝癌细胞株;以MHCC 97H肝癌细胞株作为空白对照组,检测两种细胞株FMNL-2和MMP-2基因和蛋白的表达,以确定两者之间的调控关系。2、检测低表达组、MHCC 97H两种肝癌细胞株Rho A,Rac1,Cdc42三种基因的表达情况,以验证Rho GTPases是FMNL-2的下游调控路径。另外,通过Rho A,Rac1,Cdc42三种基因的表达情况差异,筛选出具体的下游基因。3、通过Y27632抑制Rho GTPases后,以MHCC 97H作为对照组,检测FMNL-2和MMP-2的表达,以验证Rho GTPases和MMP-2的关系。从而解释FMNL-2调控MMP-2的表达是否通过Rho GTPases途径。结果:1、si RNA下调MHCC 97H细胞中FMNL-2表达后,MMP-2表达相应下降。同时Rac1表达也相应下调。western blot和rt-PCR结果均显示FMNL-2下调后,MMP-2的表达下降,且差值具有统计学意义(P0.05),说明FMNL-2可以调控MMP-2的表达。另外,FMNL-2下调后,Rho GTPases中的Rho A无变化,Cdc42略下降,但差值没有统计学意义,而Rac1 m RNA表达下降显著,差值具有统计学意义(P0.05)。2、Y27632选择性抑制MHCC 97H细胞中Rac1的活性。用30μmol/L的Y27632处理的MHCC 97H细胞中,活化的Rac1蛋白表达相对正常对照组显著下降,差值具有统计学意义(P0.05)。3、MHCC 97H细胞中Rac1表达下调后,MMP-2的表达下调。Western blot结果显示Rac1活性降低后,MMP-2的蛋白表达相对正常对照组显著下降,差值具有统计学意义(P0.05)。结论:1、Rac1可能是FMNL-2的下游调控靶基因;2、FMNL-2通过Rac1调控MHCC 97H细胞中MMP-2的表达。
【图文】：

灰度,比值

第 3 章结果.01），说明当 FMNL-2 表达下调后，MMP-2 的表达也相应下调L-2 对 MMP-2 的表达具有调控作用。（图 3.2） 3.1 各组细胞中 FMNL-2 和 MMP-2 的 mRNA 灰度比值（n＝3， x ±sFMNL-2 MMP-2A B C* D E 0.86±0.03 0.90±0.10 0.24±0.02 1.44±0.04 1.17±0.05

蛋白表达,比值,转染,灰度

第 3 章结果siRNA-FMNL2 转染组灰度比值见表 3.2。结果显示：FMNL-2 和 MMP-2 蛋白表达在 siRNA 干扰组中明显低于正常对照组和阴性对照组（*P<0.05）。（图 3.3）Rt-PCR 结果和 western blot 结果都说明，当 FMNL-2 表达下调后，MMP-2的表达也相应下调，，由此推论 FMNL-2 对 MMP-2 的表达具有调控作用。表 3.2 siRNA 干扰前后 FMNL-2、MMP-2 与 βactin 蛋白表达比值（n＝3， x ±s）normal group negative group siRNA-FMNL-2 groupFMNL-2 1.2±0.04 1.1±0.06 0.44±0.02MMP-2 0.8±0.03 0.82±0.04 0.28±0.02
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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