苜蓿MsDREB1基因的诱导表达增强大豆的耐盐性

发布时间：2019-09-10 11:07

【摘要】：基因转录调节是植物对非生物胁迫适应机制的一个重要方面,转录调节因子在胁迫信号转导途径中调节下游基因的表达,在建立植物对胁迫适应性过程中起到重要作用。DREB是功能多样的转录调节因子蛋白家族,家族成员在植物响应非生物胁迫方面扮演着重要角色。本研究以苜蓿MsDREB1基因为目的基因,分别把MsDREB1克隆到35S启动子与rd29A启动子之后,并把两种载体用农杆菌介导转入大豆基因组中,通过Southern检测转基因植株。15 d龄的幼苗在200 mmol·L~(-1)NaCl胁迫条件下,用RT-PCR分析基因不同时间的表达差异;并测定叶绿素、丙二醛、H_2O_2、SOD、相对根长及相对地上部分长度。结果表明:转MsDREB1基因在两种启动子驱动下均有一定耐盐能力,但存在差异。在非胁迫下35S启动子调控的MsDREB1为超量表达,而rd29A启动子调控MsDREB1表达量较低;在盐胁迫下,rd29A:MsDREB1表达量高于35S:MsDREB1的表达量;MsDREB1超量表达抑制植株正常生长。MsDREB1诱导表达耐盐性效果更明显,其植株脯氨酸含量、SOD活性均显著高于MsDREB1超量表达,而H_2O_2和MDA含量则显著低于MsDREB1超量表达。结果说明MsDREB1作为转录调节因子参与了植物的渗透调节,对植物的耐盐性具有贡献。该试验研究两种启动子调控的转MsDREB1基因大豆耐盐效果,为MsDREB1基因在大豆耐盐基因工程中的应用提供参考。
【图文】：

转基因,转基因大豆,试剂,耐盐性

畲蠛斓?苜蓿MsDＲEB1基因的诱导表达增强大豆的耐盐性19表1引物序列Table1Primersequences名称Name引物序列Primersequence(5'-3')rd29A(F)-P1CGGATCCGCCATAGATGCAATTCAATCAAACTrd29A(Ｒ)-P2GGGTACCCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAGAAGMsDＲEB1(F)-P3CGGTACCACACCATTTTCCACTCTATCCMsDＲEB1(Ｒ)-P4GCTGCAGTTTCCTATTCTACGATCCAAAＲT-qPCＲMsDＲEB1(F)-P5CCCTTTGACGCATCATCACCＲT-qPCＲMsDＲEB1(Ｒ)-P6TTCCTCCCTGCTCGCTTCTTＲT-qPCＲACTIN2(F)-P7TGATGGTGTGAGTCACACTGTACCＲT-qPCＲACTIN2(Ｒ)-P8GGACAATGGATGGGCCAGACTC图1重组表达载体结构简图Fig．1Constructionoftransgenicplantexpressionvector1．4．2转基因MsDＲEB1mＲNAＲT-qPCＲ分析检测对扩繁后PCＲ与Southernblot显示阳性植株(处理后)作外源基因表达量分析。以T2代纯合体4个转基因株系(rd-1/rd-2、35S-1/35S-2)及对照苗叶片为检测材料，每个株系检测3株苗。用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取转基因大豆的叶样品ＲNA。用紫外分光度计测定260nm/280nm，计算ＲNA的浓度。参照SMAＲTcDNAsynthesisKit说明书合成cDNA第一链。qPCＲ在ABI7300实时检测系统进行检测。使用试剂为PowerSybrGreenPCＲ试剂(ABI)。用P5、P6和P7、P8(表1)荧光定量PCＲ引物。反应体系参考文献进行［25］。各反应均3次重复，采用相同条件。基因拷贝数的定量方法采用双标准曲线法［25］。1．4转基因大豆耐盐性分析选取转基因及对照种子，26℃萌发，水培至“两叶一心”时期，转移入200mmol·L－1NaCl处理6，12，24h后用清水洗净植株，提取ＲNA并通过反转录反应获得cDNA。qＲT-PCＲ测定基因的表达量。将小苗转移到水培营养液中继续培养约7d。将转基因和野生型大豆分成2组。一组在新鲜的

大豆,基因,启动子调控,株系

20大豆科学1期图2大豆转MsDＲEB1基因Southern杂交分析Fig．2SouthernblotanalysisfromtransgeniclineswithexpressionMsDＲEB1genesinsoybean2．2转基因各株系MsDＲEB1表达量分析为比较启动子调控目的基因效果，在不同程度的盐胁迫下，对4个转基因株系(rd-1/rd-2、35S-1/35S-2)PCＲ及Southernblot阳性(图2)苗Ｒeal-timePCＲ检测(图3)。转MsDＲEB1株系外源基因均能表达，但由于启动子不同，基因表达量存在较大差异。未经胁迫诱导，35S启动子调控的Ms-DＲEB1为超表达，相对表达量显著高于rd29A启动子调控的MsDＲEB1表达量。经不同浓度盐胁迫处理后，MsDＲEB1表达量均增加，但rd29A启动子调控的MsDＲEB1表达量增加明显高于35S启动子调控表达量。由此表明，rd29A诱导启动子比35S组成型启动子更有利于在盐胁迫下调控基因表达。图3转基因大豆各株系200mmol·L－1NaCl胁迫处理下不同时间MsDＲEEB1表达变化Fig．3ChangeofMsDＲEEB1genesexpressioninwildtype(WT)，35S-，rd-linesundersaltstresstreatment2．3不同启动子转基因大豆耐盐性差异分析选取PCＲ阳性植株，经盐胁迫处理。rd29A启动子调控的转基因大豆长势明显好于35S，，主要表现在生根较快，地上部分生长迅速(图4)。推测CaMV-35S调控的外源基因持续超量表达抑制植株生长，与Chen等［27］在大豆中研究结果相似［27］。转录因子在组成型强启动子驱动下异源超表达，即使在正常生长条件下，也会启动基因表达。这种错误基因表达常造成转基因植株在正常生长条件下株型变异和植株矮小［8］。*表示相同处理条件下不同转基因株系与对照差异显著(P＜0．05)。下同。*indicatethesignificantdifferenceat0．05leveloftransgenicplantwithwildtypeinthesamecon-
【作者单位】：黄淮学院生物与食品工程学院;
【基金】：河南省科技发展计划(112300410042)
【分类号】：S565.1

【参考文献】