番茄中一个抗病基因功能的研究

发布时间：2019-09-13 02:34

【摘要】：植物中最大的一类抗病基因(R)编码的蛋白质含有卷曲螺旋结构(coiled-coil,CC)、核苷酸结合位点(nucleotide-binding site,NBS)和富含亮氨基酸的重复序列(leucine-rich repeat,LRR)结构域。R基因以抗病著称。文章通过酵母双杂筛选方式获得了DDI3基因,该基因与番茄中重要功能基因DDB1具有相互作用,而又含有CC-NBS-LRR结构,预测具有R基因抗病性,参与植物抗病。研究中构建了DDI3过表达载体并通过根瘤农杆菌介导转化到野生型番茄中,筛选获得DDI3高表达的阳性转基因株系。通过病菌接种实验,观察植株发病情况和统计细菌菌落数,结果发现,转基因植株的抗病性明显高于野生型番茄。DDI3基因对提高番茄的抗病性有很高的价值,为采用基因工程方法改良番茄植株抗病性做出新的尝试,同时又与番茄DDB1基因具有相互作用,对研究DDB1基因在参与植物抗病途径中的功能研究提供新的方向。
【图文】：

序列,表达载体,基因,转基因植株

基因与测序以番茄ｃＤＮＡ为模板，用ＤＤＩ３－Ｆ１和ＤＤＩ３－Ｒ１为外侧引物ＰＣＲ扩增。再以ＰＣＲ产物为模板，以ＤＤＩ３－Ｆ２和ＤＤＩ３－Ｒ２为内侧引物扩增，产物电泳检测结果如图１所示，图１中，，扩增产物为一条特异条带，与预期的番茄ＤＤＩ３基因片段２５１１ｂｐ大小一致。将其连接到ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ载体上，酶切鉴定正确，送测序。测序结果用ＤＮＡＭＡＮ和Ｃｈｒｏｍａｓ软件分析序列，与番茄ＤＤＩ３基因在番茄基因组中序列一致。图１ＤＤＩ３基因ＰＣＲ扩增２．２表达载体鉴定用ＳｍａⅠ和ＸｈｏⅠ进行双酶切得到与预期结果大小一致２５１１ｂｐ的ＤＤＩ３基因片段，证明ＤＤＩ３基因已经连接到植物表达载体３５Ｓ－ｐＢＩ１２１上，如图２所示。图２ｐＢＩ１２１－３５Ｓ－ＤＤＩ３载体双酶切鉴定结果２．３转基因植株的鉴定植物组织培养获得转基因番茄株系，从叶片中提取转基因植株基因组ＤＮＡ，利用植物表达载体ｐＢＩ１２１携带的ＮＰＴⅡ基因对植株进行阳性鉴定，预期扩增片段长度为８５７ｂｐ。共得到组培苗１２株，其中６株经过鉴定为转基因番茄苗，结果如图３所示。图３表明，负对照野生型植株ＤＮＡ未能扩增出８５７ｂｐ条带，而正对照３５Ｓ－ｐＢＩ１２１质粒和转基因株系ＤＮＡ扩增出８５７ｂｐ条带，说明携带ＮＰＴⅡ基因的载体片段已整合于受体植株核染色体组中。图３转基因番茄植株的ＰＣＲ鉴定２．４转基因植株的表型ＤＤＩ３转基因植株与野生型生长状况相比，没有明显差异，转基因植株果实颜色在成熟时期与

序列,转基因植株,载体,转基因番茄

一条特异条带，与预期的番茄ＤＤＩ３基因片段２５１１ｂｐ大小一致。将其连接到ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ载体上，酶切鉴定正确，送测序。测序结果用ＤＮＡＭＡＮ和Ｃｈｒｏｍａｓ软件分析序列，与番茄ＤＤＩ３基因在番茄基因组中序列一致。图１ＤＤＩ３基因ＰＣＲ扩增２．２表达载体鉴定用ＳｍａⅠ和ＸｈｏⅠ进行双酶切得到与预期结果大小一致２５１１ｂｐ的ＤＤＩ３基因片段，证明ＤＤＩ３基因已经连接到植物表达载体３５Ｓ－ｐＢＩ１２１上，如图２所示。图２ｐＢＩ１２１－３５Ｓ－ＤＤＩ３载体双酶切鉴定结果２．３转基因植株的鉴定植物组织培养获得转基因番茄株系，从叶片中提取转基因植株基因组ＤＮＡ，利用植物表达载体ｐＢＩ１２１携带的ＮＰＴⅡ基因对植株进行阳性鉴定，预期扩增片段长度为８５７ｂｐ。共得到组培苗１２株，其中６株经过鉴定为转基因番茄苗，结果如图３所示。图３表明，负对照野生型植株ＤＮＡ未能扩增出８５７ｂｐ条带，而正对照３５Ｓ－ｐＢＩ１２１质粒和转基因株系ＤＮＡ扩增出８５７ｂｐ条带，说明携带ＮＰＴⅡ基因的载体片段已整合于受体植株核染色体组中。图３转基因番茄植株的ＰＣＲ鉴定２．４转基因植株的表型ＤＤＩ３转基因植株与野生型生长状况相比，没有明显差异，转基因植株果实颜色在成熟时期与野生型植株果实基本一致，虽然具有抗病ＣＣ－ＮＢＳ－ＬＲＲ结构，但未能改变番茄的表型性状。发苗实验中，在相同实验条件下，可以观察到相同生长期内ＤＤＩ３转基因种子萌发速率要慢于野生型ＡＣ番茄种子。２．５接种Ｐｓｔ．ＤＣ３０００
【作者单位】：合肥工业大学食品科学与工程学院;
【基金】：国家自然科学基金资助项目(31171179)
【分类号】：Q943.2;S436.412

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