沉默SIRT2基因对急性粒细胞白血病细胞增殖的影响

发布时间：2019-09-21 14:19

【摘要】：目的 SIRT2是组蛋白去乙酰化酶家族成员之一,其参与多种肿瘤的发生和发展。本研究旨在探讨SIRT2基因在人急性粒细胞白血病细胞NB4和耐药细胞HL60/A增殖中的作用,分析SIRT2对于细胞周期的影响,寻找治疗急性粒细胞白血病的新靶点。方法蛋白质印迹法检测SIRT2在急性粒细胞白血病细胞HL60/A和NB4中的表达,针对SIRT2mRNA不同的靶序列设计并合成shRNA,构建真核表达干扰载体,制备慢病毒并感染HL60/A和NB4细胞,用嘌呤霉素筛选出稳定表达shRNA的细胞,应用蛋白质印迹法验证干扰效率;采用改良MTT法检测沉默SIRT2基因前后HL60/A和NB4细胞增殖的改变;用流式细胞术检测沉默SIRT2基因前后细胞周期的变化。结果在HL60/A和NB4细胞中SIRT2蛋白表达水平均增高,F=43.22,P=0.002。用慢病毒感染HL60/A(F=184.9,P0.001)和NB4(F=354.7,P0.001)后,SIRT2基因的蛋白表达水平显著降低。MTT结果显示,与对照组细胞比较,48h沉默SIRT2基因的HL60/A(F=208.4,P0.001)和NB4(F=27.58,P0.001)细胞的生长速度变慢;于72h这种抑制作用更加明显,其中HL60/A的增殖速度明显变慢,F=555.9,P0.001。流式细胞术检测细胞周期结果显示,G_0~G_1期百分比,与对照组HL60/A/con(27.62±1.01)%相比,干扰组HL60/A/sh1(37.14±0.03)%(F=7.61,P0.001)和HL60/sh2(37.51±3.63)%(F=3.89,P=0.009)比例显著增加;与对照组NB4/con(27.49±0.50)%相比,干扰组NB4/sh1(38.26±1.93)%(F=8.02,P=0.007)和NB4/sh2(35.23±1.11)%(F=3.50,P0.001)比例显著增加;S期细胞百分比,与对照组HL60/A/con(51.94±1.15)%相比,干扰组HL60/A/sh1(40.24±0.66)%(F=3.34,P0.001)和HL60/sh2(42.73±2.76)%(F=10.33,P=0.004)比例显著降低;与对照组NB4/con(50.65±0.23)%相比,干扰组NB4/sh1(39.58±1.11)%(F=3.02,P0.001)和NB4/sh2(43.82±1.33)%(F=10.42,P=0.011)比例显著降低;G2~M期细胞比例无明显变化。结论干扰SIRT2基因的表达可使细胞周期阻滞在G_0~G_1期,从而抑制急性粒细胞白血病细胞HL60/A和NB4的增殖。
【图文】：

蛋白质印迹法,白血病细胞系,表达水平,细胞周期

速度显著降低（图３）。两种细胞的结果一致，证明沉默ＳＩＲＴ２能够抑制ＨＬ６０／Ａ和ＮＢ４细胞的增殖能力。该结果提示我们ＳＩＲＴ２是ＨＬ６０／Ａ和ＮＢ４细胞增殖调控的关键因子，，可能是维持急性粒细胞白血病细胞生长的关键因素。图１蛋白质印迹法检测ＳＩＲＴ２在白血病细胞系中蛋白的表达水平２．４流式细胞术检测细胞周期变化细胞周期结果显示，当ＨＬ６０／Ａ和ＮＢ４细胞内ＳＩＲＴ２表达下调后，细胞周期进程受到抑制，细胞周期被阻滞在Ｇ０～Ｇ１期（图４）。单因素方差分析结果显示，３组细胞ＨＬ６０／Ａ／ｃｏｎ、ＨＬ６０／Ａ／ｓｈ１和ＨＬ６０／Ａ／ｓｈ２Ｇ０～Ｇ１期（Ｆ＝２８．４６，Ｐ＝０．００４）和Ｓ期（Ｆ＝９９．３５，Ｐ＜０．００１）细胞数量百分比差异有统计学意义；３组细胞ＮＢ４／ｃｏｎ、ＮＢ４／ｓｈ１和ＮＢ４／ｓｈ２Ｇ０～Ｇ１期（Ｆ＝３７．５２，Ｐ＝０．００３）和Ｓ期（Ｆ＝１０２．０，Ｐ＜０．００１）细胞数量百分比差异有统计学意义。在ＨＬ６０／Ａ中沉默ＳＩＲＴ２后，ＨＬ６０／Ａ／ｓｈ１和ＨＬ６０／Ａ／ｓｈ２细胞Ｇ０～Ｇ１期细胞比例由（２７．６２±１．０１）％分别上升到（３７．１４±０．０３）％（Ｆ＝７．６１，Ｐ＜０．００１）和（３７．５１±３．６３）％（Ｆ＝３．８９，Ｐ＝０．００９）；Ｓ期细胞比例由（５１．９４±１．１５）％分别下降到（４０．２４±０．６６）％（Ｆ＝３．３４，Ｐ＜０．００１）和

蛋白质印迹法,细胞周期阻滞,去乙酰化,细胞周期进程

／Ａ和ＮＢ４的细胞周期进程，将细胞周期阻滞在Ｇ０～Ｇ１期，这可能是细胞生长变慢的主要原因。注：Ａ．ｓｈＲＮＡ干扰前后，ＳＩＲＴ２在ＨＬ６０／Ａ细胞中蛋白表达水平比较；Ｂ．ｓｈＲＮＡ干扰前后，ＳＩＲＴ２在ＮＢ４细胞中蛋白表达水平比较图２蛋白质印迹法检测沉默ＳＩＲＴ２基因后细胞中ＳＩＲＴ２的表达水平注：Ａ．沉默ＳＩＲＴ２先后ＨＬ６０／Ａ的增殖曲线；Ｂ．沉默ＳＩＲＴ２前后ＮＢ４的增殖曲线；与对照组相比，ａＰ＜０．０５；ｂＰ＜０．０１图３ＭＴＴ法检测沉默ＳＩＲＴ２对细胞增殖活性的影响３讨论ＳＩＲＴ２属于第３类组蛋白去乙酰化酶家族成员［７］，主要通过对靶分子的去乙酰化作用参与细胞周期、分化、迁移、炎症反应及新陈代谢等生物学过程［８－１１，１４－１５］。近年来研究发现，ＳＩＲＴ２还参与多种肿瘤·１４９中华肿瘤防治杂志·２０１６年２月第２３卷第３期ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶＴＲＥＡＴ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０１６，Ｖｏｌ．２３Ｎｏ．３
【作者单位】：中国医学科学院·北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金(81170510;81402432) 天津市自然科学基金(14JCZDJC34900)
【分类号】：R733.71

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