基于琼脂扩散法建立检测尿液和血清抗氧化能力方法的临床应用及机体抗氧化能力与SIRT1基因突变的关联

发布时间：2019-09-21 17:20

【摘要】：目的:基于氧化还原滴定反应,建立线性好、重复性好的高锰酸钾琼脂法和碘淀粉琼脂法,以测定尿液和血清中的总抗氧化物质。将高锰酸钾琼脂法和碘淀粉琼脂法用于对ICU患者的血清和尿液中的总抗氧化物质含量的检测,以验证两法在临床的可用性。用碘淀粉琼脂法对冠心病患者尿液中的总抗氧化物质含量及可能的抗氧化机制进行探讨。将高锰酸钾琼脂法和碘淀粉琼脂法联合应用于评价非选择性肿瘤患者尿液和血清中的总抗氧化物质含量及可能的抗氧化机制探讨,并绘制了诊断肿瘤疾病的ROC曲线。分析了尿液和血清抗氧化能力与尿干化学指标和血清生化指标间的关系及可能机制。用两对引物-聚合酶链反应法(PCR-CTPP)技术分析健康人群SIRT1基因rs7895833 AG序列的多态性,探讨SIRT1基因启动子序列单核苷酸多态性与机体抗氧化能力的关系。方法:1.基于高锰酸钾氧化还原滴定法建立了高锰酸钾琼脂法。将已知浓度的氧化剂高锰酸钾与琼脂混合制作高锰酸钾琼脂平板,将尿液或者血清加入琼脂中与氧化剂高锰酸钾反应,24小时避光隔氧充分反应后测量扩散环大小,计算扩散环面积,评估尿液或者血清中含有的总抗氧化物质的多少。按照NCCLS的EP5-A2文件对方法的精密度作出评价,用线性实验评价方法的准确性。对30例ICU患者和44例健康人群的血清,利用高锰酸钾琼脂法测定总抗氧化物质的含量。2.基于碘氧化还原滴定法建立了碘淀粉琼脂法。将已知浓度的氧化剂碘、指示剂淀粉与琼脂混合制作碘淀粉琼脂平板,将尿液或者血清加入琼脂中与氧化剂碘反应,24小时避光隔氧充分反应后测量扩散环大小,计算扩散环面积,评估尿液或者血清中含有的总抗氧化物质的多少。按照NCCLS的EP5-A2文件对方法的精密度作出评价,用线性实验评价方法的准确性。对30例ICU患者和44例健康人群的尿液,利用碘淀粉琼脂法测定其总抗氧化物质的含量。3.利用碘淀粉琼脂法对44例冠心病患者和44例健康人群的尿液中总抗氧化物质含量进行检测,并探讨了尿液中的抗氧化物质在冠心病的发生时可能的抗氧化机制。4.使用两种方法分别对44例非选择性肿瘤患者和44例健康人群的尿液和血清中的总抗氧化物质含量进行测定并探讨了可能机制,根据尿液和血清在两种方法中的扩散面积建立回归模型,根据回归模型绘制了诊断肿瘤疾病的ROC曲线。5.利用相关分析和Logistic条件回归后退法分析了尿液和血清抗氧化能力与尿干化学指标和血清生化指标间的关系及可能机制。6.用两对引物-聚合酶链反应法(PCR-CTPP)技术分析健康人群SIRT1基因rs7895833 AG序列的多态性,探讨SIRT1基因启动子序列单核苷酸多态性与机体抗氧化能力的关系。结果:1.在高锰酸钾琼脂法检测尿液标本的精密度实验评价中,高水平尿液样本的扩散面积批内、批间和天间变异系数分别为3.8%、8.7%和10.6%;低水平尿液样本的扩散面积批内、批间和天间变异系数分别为2.6%、9.6%和14.0%。评价高锰酸钾琼脂法检测标准还原性物质的线性实验,线性方程中R2为0.994;评价高锰酸钾琼脂法检测带基质样本的线性实验,线性方程中R2为0.902。在高锰酸钾琼脂法检测血清标本的精密度实验评价中,高水平血清高水平样本的扩散面积批内、批间变异系数分别为2.9%和12.3%;低水平血清样本的扩散面积批内、批间变异系数分别为3.0%和5.1%。由于在计算天间方差时,出现负值,依据EP5-A2文件,将天间标准差设置为0,故未计算天间变异系数。评价高锰酸钾琼脂法检测标准还原性物质的线性实验,线性方程中R2为0.994;评价高锰酸钾琼脂法检测带基质样本的线性实验R2为0.987。将高锰酸钾琼脂法用于检测ICU患者血清中总抗氧化物质含量时,ICU患者血清扩散面积的中位数为1.77 cm2,健康人群的为2.01cm2,两组血清扩散面积比较,p值为0.002,差异有统计学意义。2.在碘淀粉琼脂法检测尿液标本的精密度实验评价中,高水平尿液样本的扩散面积批内、批间和天间变异系数分别为5.1%、9.1%和8.1%;低水平尿液样本的扩散面积批内、批间和天间变异系数分别为2.7%、9.5%和8.1%。评价碘淀粉琼脂法检测标准还原性物质的线性实验,线性方程中R2为0.999;评价碘淀粉琼脂法检测带基质样本的线性实验,线性方程中R2为0.995。在碘淀粉琼脂法检测血清标本的精密度实验评价中,高水平血清样本的扩散面积批内、批间和天间变异系数分别为2.9%、5.4%和7.1%;低水平血清样本的扩散面积批内、批间和天间变异系数分别为3.6%、5.9%和14.9%。评价碘淀粉琼脂法检测标准还原性物质的线性实验,线性方程中R2为0.999;评价碘淀粉琼脂法检测带基质样本的线性实验R2为0.990。将碘淀粉琼脂法用于检测ICU患者尿液中总抗氧化物质含量时,ICU患者尿液扩散面积的中位数为1.38 cm2,健康人群的为1.13 cm2,两组尿液扩散面积比较,p值为0.021,差异有统计学意义。3.将碘淀粉琼脂法用于冠心病人尿液中总抗氧化物质含量的检测时,冠心病患者尿液中总抗氧化物质扩散面积中位数为0.95 cm2,而健康人群尿液中总抗氧化物质扩散面积中位数为1.13 cm2,两组尿液扩散面积比较,p值为0.001,差异有统计学意义。4.将两法分别用于检测非选择性肿瘤患者尿液和血清中的总抗氧化物质含量时,尿液标本在高锰酸钾琼脂扩散中,肿瘤患者扩散面积的中位数为1.83 cm2,健康人群的为1.54 cm2,两组尿液扩散面积比较,p值为0.038,差异有统计学意义;尿液标本在碘淀粉琼脂扩散中,肿瘤患者扩散面积中位数为1.54 cm2,健康人群的为1.13 cm2,两组尿液扩散面积比较,p值为0.016,差异有统计学意义。血清标本在高锰酸钾琼脂扩散中,肿瘤患者扩散面积为2.02±0.46 cm2,健康人群为1.97±0.17 cm2,两组血清扩散面积比较,p值为0.158,尚不能认为有统计学差异;血清标本在在碘淀粉琼脂扩散中,肿瘤患者血清扩散面积为3.20±0.40cm2,健康人群为2.94±0.46 cm2,两组血清扩散面积比较,p值为0.005,差异有统计学意义。将尿液和血清标本在两种方法中的扩散面积拟合用于诊断肿瘤疾病发病风险时,只有尿液在碘淀粉琼脂中的扩散面积(UI)和血清在碘淀粉琼脂中的扩散面积(SI)进入回归方程,回归模型为Y=0.850 UI+2.209 SI-7.691,此时的ROC曲线下面积(AUC)为0.787。5.以Spearman秩相关分析尿液和血清扩散面积与尿干化学指标和血清生化指标的关系,发现尿液扩散面积与尿干化学中的尿胆原、尿蛋白、尿糖、p H、尿比密、浊度和尿色存在相关性,其p值分别为0.048、0.001、0.005、0.001、0.001、0.040和0.001;与血清生化指标中的血糖、尿素、肌酐、白蛋白、球蛋白、胆固醇和甘油三酯存在相关性,其p值分别0.012、0.001、0.017、0.001、0.016、0.043和0.038。血清的扩散面积与尿干化学中的尿胆原和尿液颜色相关,其p值为0.033和0.017;与血清生化指标中的血糖、尿酸、白蛋白、胆固醇和甘油三酯相关,其p值分别为0.011、0.004、0.001、0.041和0.013。Logistic回归后退法进一步分析显示,尿蛋白、p H、尿色、血清中白蛋白和甘油三酯进入与尿液扩散面积有关的回归模型,其p值分别为0.001、0.001、0.001、0.056和0.080;尿胆原、尿蛋白、p H、白细胞、尿色、血清尿素、血清尿酸和血清白蛋白进入与血清扩散面积有关的回归模型,其p值分别为0.066、0.025、0.016、0.001、0.017、0.003、0.005和0.001。6.分析机体抗氧化能力与SIRT1基因多态性的关系,在启动序列rs7895833AG基因多态性中,AA基因型占3.1%,AG基因型占43.1%,GG基因型占53.8%,A等位基因占24.6%,G等位基因占75.4%,基因型分布频率符合Hardy-Weinberg平衡(p=0.067),血清的抗氧化能力与AG基因型(p=0.009)和GG基因型(p=0.010)均存在相关性。结论:1.建立了高锰酸钾琼脂法和碘淀粉琼脂法检测尿液和血清中总抗氧化物质的含量的方法,方法适用于检测尿液和血清中含有的总抗氧化物质含量,在临床具有应用价值。2.各类疾病发生时,机体有不一样的抗氧化机制。在冠心病发生时,尿液中抗氧化物质可以对抗氧化损伤;在肿瘤疾病发生时,尿液中含有的抗氧化物质比血清更能敏感的对抗氧化损伤,对尿液中总抗氧化物质含量的检测有助于对疾病的诊断。3.尿液和血清中抗氧化物质发挥抗氧化作用的机制是独立的。4.SIRT1基因启动子序列的基因突变会影响血清的抗氧化能力。
【图文】：

高锰酸钾,琼脂,尿液,琼脂扩散

学附属第一医院和大连医科大学附属第二医院检验科。血清标本储存于-20 ℃保存，实验前平衡至室温。按照 1.1 试剂部分和方法部分，对待测血清的总抗氧化物质含量进行测定，，并用文献报道的方法对相同的标本进行测定以验证方法的准确性。扩散结果利用统计软件 SPSS 13.0 进行统计学处理，非参数秩和检验用于比较两组结果，p<0.05 认为有统计学意义。结果1 扩散结果图 1-1 为来自不同个体的尿液样本在高锰酸钾琼脂中的扩散结果，左琼脂扩散环面积大于右琼脂扩散环面积，左样本含有更多的抗氧化物质。图 1-2 为来自不同个体的血清样本在高锰酸钾琼脂中的扩散结果，右琼脂扩散环面积大于左琼脂扩散环面积，右样本含有更多的抗氧化物质。

高锰酸钾,琼脂,血清,琼脂扩散

学附属第一医院和大连医科大学附属第二医院检验科。血清标本储存于-20 ℃保存，实验前平衡至室温。按照 1.1 试剂部分和方法部分，对待测血清的总抗氧化物质含量进行测定，并用文献报道的方法对相同的标本进行测定以验证方法的准确性。扩散结果利用统计软件 SPSS 13.0 进行统计学处理，非参数秩和检验用于比较两组结果，p<0.05 认为有统计学意义。结果1 扩散结果图 1-1 为来自不同个体的尿液样本在高锰酸钾琼脂中的扩散结果，左琼脂扩散环面积大于右琼脂扩散环面积，左样本含有更多的抗氧化物质。图 1-2 为来自不同个体的血清样本在高锰酸钾琼脂中的扩散结果，右琼脂扩散环面积大于左琼脂扩散环面积，右样本含有更多的抗氧化物质。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R440

【参考文献】