GH45家族纤维素酶基因的挖掘及高效表达

发布时间：2019-09-21 21:52

【摘要】：GH45家族纤维素酶因具有较高的脱毛活性而成为了主要的纺织用纤维素酶,被广泛应用于生物抛光和生物石磨洗。然而该家族发现和表征过性质的酶的数量远比其他家族纤维素酶要少,且多数的酶是从原菌纯化得来,产量较低。此外,应用效果较好的几个GH45家族纤维素酶都已被专利保护,限制了我们的使用。获得高效的、高产的新型纺织用纤维素酶及其生产菌株是本研究的主要目标。本研究通过简并引物和热不对称交错PCR(TAIL-PCR)直接从环境宏基因组和直接从测序真菌Neurospora crassa中克隆基因的方法,获得了两个新GH45家族纤维素酶基因nmGH45和ncGH45,并成功在毕赤酵母中进行了表达。重组蛋白rNMgh45和rNcGH45都是单一条带,摇瓶水平表达量分别为660 mg/ml和80 mg/ml;二者均有良好的pH稳定性及热稳定性,以及适用于纺织工业的最适pH及最适温度范围,并有着一定的应用效果。水解产物分析表明,rNMgh45与rNcGH45对多糖的水解产物主要是纤维五糖。多数金属离子对rNMgh45和rNcGH45没有明显提高或抑制作用,而SDS有很强的抑制作用。而还原剂DTT和β-巯基乙醇可使对两个酶都有一定促进作用。此外rNMgh45有极佳的盐溶液和离子溶液抗性。分子动力学模拟表明,在1M NaCl溶液中,rNMgh45无论是分子结构变化的程度,还是分子中各氨基酸的偏移程度都很小。对纺织品脱毛实验的结果表明,酶的添加量为10U时,rNMgh45和rNcGH45造成纺织品的减量率分别为1.81%和1.55%。本实验就rNMgh45酶表达水平的提高做了一系列研究。首先尝试突变rNMgh45中的二硫键来提高其活性,然而当rNMgh45中的二硫键突变后,其酶活性完全丧失,推测是由于二硫键在维持其构象方面具有重要作用。其次,研究了共表达伴侣蛋白对表达量的影响。结果表明,共表达BiP对rNMgh45表达量有20%的提高作用,PDI,HAC1及PDI同BiP的共同表达对表达量无影响或有部分抑制作用。最后,研究了培养条件对表达量的影响,结果表明,1.0%甲醇浓度与0.5%甲醇浓度相比,可使表达量提高90%;培养基pH及初始接种量则对表达量影响不大。同时,本研究选取了四个已知具有良好应用效果的GH45家族纺织酶Egl3,STCE1,MCE1,RCE1,进行了密码子优化并在毕赤酵母中进行了异源表达。结果显示,四个经密码子优化的GH45家族纤维素酶表达量均在20 U/ml左右,大部分远高于文献报道的结果。本文对GH45家族纤维素酶进行了比较深入透彻的研究,发现了两个具有应用潜力的酶,同时对影响蛋白表达水平的多个因素进行了研究,为GH45家族纤维素酶的工业化应用提供了很好的理论依据和技术支持。
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q55

【参考文献】