一个甲基转移酶基因lomo3在洛蒙真菌素生物合成途径中的功能

发布时间：2019-09-21 22:29

【摘要】：【目的】洛蒙真菌素是在洛蒙德链霉菌(Streptomyces lomondensis)中生物合成的一种具有广谱抑菌活性的吩嗪类抗生素,但其合成机理仍不清晰。在洛蒙德链霉菌S015的洛蒙真菌素生物合成核心基因簇下游,有一甲基转移酶基因——lomo3,研究该基因对洛蒙真菌素生物合成的影响。【方法】对lomo3基因进行无痕敲除得到基因缺失突变株S015Δlomo3,再过表达重组质粒构建回补突变株S015Δlomo3::lomo3,比较两株突变株与野生型S015的发酵产物的变化。【结果】发现基因缺失菌株S015Δlomo3不能合成洛蒙真菌素,而基因回补菌株S015Δlomo3::lomo3则可恢复洛蒙真菌素的合成能力。【结论】甲基转移酶基因lomo3在洛蒙真菌素生物合成过程中起着重要的作用,但该基因的具体功能还有待深入研究。研究对于阐明洛蒙真菌素的生物合成途径具有一定的指导作用。
【图文】：

提取物5，NaCl10，固体加琼脂15；MS培养基(g/L)：黄豆饼粉30，加水煮沸后过滤，加甘露醇20，琼脂20；2×YT培养基(g/L)：酵母提取物10，胰蛋白胨10，氯化钠5；1.0×105Pa，20min高温灭菌。YEME培养基(g/L)：葡萄糖4，麦芽提取物10，酵母提取物4；0.68×105Pa高温灭菌20min。1.1.3菌株和质粒：所用菌株及质粒信息见表1。1.1.4引物：所用引物及具体信息见表2。1.2实验方法1.2.1菌株培养：洛蒙德链霉菌S015及其突变株的培养条件为28°C、180r/min。MS培养基用于产孢培养和固体种子培养；YEME培养基用于液体种图1洛蒙真菌素生物合成基因簇[10]Figure1Biosynthesisgeneclusteroflomofungin[10]表1菌株和质粒Table1Strainsandplasmidsusedinthisstudy菌株或质粒Strainsandplasmids特点Characteristics来源ReferenceEscherichiacoliDH5α克隆宿主TranGenBoitechET12567(pUZ8002)接合转移供体菌，KmR，CmRMacNeil等[11]StreptomyceslomondensisS015野生型本实验室保存S015Δlomo3lomo3基因敲除突变株本实验室保存S015Δlomo3::lomo3lomo3基因回补菌株，AprR本实验室保存PlasmidspKC1139大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，温控型，AprRBierman等[12]pIB139链霉菌整合型质粒，包含强启动子PermE*，AprRWilkinson等[13]pMD19-Tvector克隆载体，AmRTaKaRapCC701lomo3基因同源左臂连接在pMD19-T载体上，AmR本实验室保存pCC702lomo3基因同源右臂连接在pMD19-T载体上，AmR本实验室保存pCC703lomo3基因左右同源臂拼接在pMD19-T载体上，AmR本实验室保存pKC1139-lomo3lomo3基因左右同源臂重组连接在pKC1139-T载体上，用于lomo3基因同框缺失，AprR本实验室保存pCC704lomo3完整

分析[15]：流动相为乙腈:0.1%的甲酸水溶液，梯度为：04min，2:8；420min，4:6；2030min，2:8；流速为1mL/min，检测波长270nm；采用AgilentTechnologies1260Infinity高效液相色谱仪，250mm×4.6mm的Agilent5μmEclipsePlusC18色谱柱。2结果与分析2.1lomo3基因敲除和回补2.1.1基因缺失菌株S015Δlomo3的构建：甲基转移酶基因lomo3全长819bp，设计的左、右同源臂长度分别为1.9kb和2.0kb，包含了lomo3基因左端的58bp和右端的188bp，预期敲除长度为lomo3中间的573bp序列。扩增lomo3基因左、右同源臂，结果如图2A所示。用lomo3left-F和lomo3right-R引物验证重组载体pKC1139-lomo3的构建结果，产物大小为左、右同源臂的总长3.9kb，如图2B所示，说明构建成功。用引物lomo3left-F和lomo3right-R检验基因缺失菌株S015Δlomo3是否构建成功：野生株的PCR产物长度为4.5kb，由于lomo3基因的敲除长度为573bp，突变株的的PCR产物长度应为3.9kb，从图2C可以看出，产物长度与预期相符，说明基因缺失菌株S015Δlomo3构建成功。2.1.2回补株S015Δlomo3::lomo3的构建：用引物lomo3-F、lomo3-R扩增lomo3完整的基因片段，构建整合载体pIB139-lomo3并导入S015Δlomo3中。用引物pIB-F和pIB-R验证回补菌株S015Δlomo3::lomo3的筛选结果。从图3可以看出，菌株S015Δlomo3::lomo3的PCR产物长度为1.3kb，，与预期结果符合，而基因缺失菌株中则没有该条图2突变质粒pKC1139-lomo3构建及lomo3基因敲除突变株验证电泳图谱Figure2ConstructionofpKC1139-lomo3plasmidinvitroandvalidationoflomo3geneknock-outstrain注：M：1kbplusDNAladdermarker.A：1、2：以全基因组为模板，扩增lomo3基因左、右同源臂序列.B：1：以pKC1139-lomo3为模板，扩增同源臂序
【作者单位】： 上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室;
【基金】：国家863计划项目(No.2012AA022107) 国家自然科学基金项目(No.20706037) 国家973计划项目(No.2012CB721005)~~
【分类号】：Q936

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 倪志勇;吕萌;马文静;陈艳;范玲;;棉花咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆及表达[J];西北植物学报;2009年10期

2 李雪平;高志民;彭镇华;岳永德;;绿竹咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆与分析[J];分子植物育种;2008年03期

3 李波;倪志勇;石庆华;范玲;;棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定[J];西北植物学报;2010年09期

4 钱文成;陈德富;王绘砖;王永芹;陈喜文;;甘蓝型油菜γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆和功能验证[J];植物生理学通讯;2007年04期

5 阎浩林,池田治生,大村智,野野宫;Milbe mycin C5-O-甲基转移酶基因的克隆[J];生物技术;2002年02期

6 凌娜;刘浩;贾海英;闫延涛;尹钧;李永春;孟凡荣;;小麦甲基转移酶基因TaDnMT2的克隆及特性分析[J];植物生理学报;2012年01期

7 宋银;王东浩;吴锦斌;周露;王国栋;王U喼

本文编号：2539589