灯盏花ARC1基因的克隆及序列分析

发布时间：2019-09-22 00:15

【摘要】：本研究对灯盏花ARC1基因进行克隆及序列分析。根据实验室前期预测灯盏花的序列设计引物,以灯盏花花蕾为材料提取RNA作为模板,通过反转录(RT-PCR)扩增得到cDNA,作为PCR扩增的模板,将扩增的ARC1基因连接到p MD19-T上,阳性克隆经PCR检测后进行测序结果分析,得到2 199 bp的核酸序列。序列分析结果表明,该基因存在2个结构域,不存在内含子,编码733个氨基酸,其核酸序列的同源性达到64%以上,氨基酸序列同源性达61%。本研究首次从灯盏花中克隆出ARC1基因,为后期研究该基因提供理论基础。
【图文】：

饷虮簧秆〕觯囵庑┗饷蚩赡懿斡氲普祷ǖ淖越徊?亲和反应。本研究利用RT-PCR克隆了ARC1基因，再利用MEGA等多种生物信息学工具对-ARC1基因开放阅读框、同源性及系统进化树进行分析，意在分析菊科自交不亲和信号传递路径中相关蛋白的功能作用，为菊科自交不亲和信号传递机理的研究提供理论基础。1结果与分析1.1总RNA的提取及检测以灯盏花花蕾为材料提取总RNA，更换新的1×TAE缓冲液，0.1%的琼脂糖凝胶进行短时间的电泳检测，结果表明：28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA的条带清晰，且28S的量接近18S的2倍(图1)，说明提取的RNA具有完整性，A260/A280在1.8~2.0之间，证明RNA的纯度可以用于后续进一步的研究。1.2RT-PCR扩增cDNA为模板是通过总RNA反转录得到，用P1和P2对ARC1进行PCR扩增。扩增产物经凝胶电泳图1灯盏花花蕾总RNA凝胶电泳Figure1TotalRNAgelelectrophoresisofErigeronbreviscapusbuds检测大约2200bp(图2)，且上下无杂带，大小与目标基因一致，可能是ARC1基因片段，需一步鉴定。1.3阳性克隆的鉴定将扩增出来的产物经回收、纯化后连接到pMD19-T克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α，并涂于氨苄抗性的LB培养基上，过夜，从转化的培养基上随机挑取5个克隆并进行PCR扩增检测，其大小约为2200bp(图3)，与RT-PCR结果一致，表明这些克隆可能为阳性克隆，挑其中两个单克隆进行摇菌，提取质粒送测序。图2ARC1基因RT-PCR电泳检测注:M:DNAmarker;1,2:RT-PCR产物Figure2ElectrophoresisdetectionofARC1geneRT-PCRproductsNote:M:DNAmarker;1,2:RT-PCRproducts图3ARC1基因重组质粒PCR电泳检测注:M:DNAmarker:1~5:阳性克隆Figure3Electrophoresisdetecti

因片段，，需一步鉴定。1.3阳性克隆的鉴定将扩增出来的产物经回收、纯化后连接到pMD19-T克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α，并涂于氨苄抗性的LB培养基上，过夜，从转化的培养基上随机挑取5个克隆并进行PCR扩增检测，其大小约为2200bp(图3)，与RT-PCR结果一致，表明这些克隆可能为阳性克隆，挑其中两个单克隆进行摇菌，提取质粒送测序。图2ARC1基因RT-PCR电泳检测注:M:DNAmarker;1,2:RT-PCR产物Figure2ElectrophoresisdetectionofARC1geneRT-PCRproductsNote:M:DNAmarker;1,2:RT-PCRproducts图3ARC1基因重组质粒PCR电泳检测注:M:DNAmarker:1~5:阳性克隆Figure3ElectrophoresisdetectionofARC1generecombinantplasmidPCRproductsNote:M:DNAmarker;1~5:Positiveclones灯盏花ARC1基因的克隆及序列分析CloningandSequenceAnalysisofARC1GenefromErigeronbreviscapus4390
【作者单位】： 云南农业大学农学与生物技术学院;西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心;红河学院;中国科学院西双版纳热带植物园;
【基金】：国家自然科学基金项目(81760692;81503184) 2016云南省中青年学术和技术带头人后备人才项目共同资助
【分类号】：Q943.2;S567.239

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本文编号：2539632