嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达

发布时间：2019-09-25 04:58

【摘要】：【目的】通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现木糖苷酶的高效表达。【方法】基于毕赤酵母密码子偏好性优化嗜热棉毛菌β-木糖苷酶(Xyl43)基因密码子,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达,并对重组木糖苷酶酶学性质进行分析。通过单因素实验优化高产菌株的摇瓶发酵条件,并在5 L发酵罐中进行扩大培养。【结果】Xyl43基因优化后的序列中222个碱基发生改变,G+C含量由52.8%降低到44.6%,序列一致性为78.17%;将构建的表达载体p PIC9K-Opt Xyl43电击转入毕赤酵母中,利用平板初筛和摇瓶复筛获得一株高效表达重组菌(命名为P.pastoris GS115-Xyl43);其所产重组木糖苷酶大小为51.5 k D,动力学参数Km为2.93 mmol/L、Vmax为157.9μmol/(min·mg),最适反应温度55°C,最适p H 7.0,在p H 6.0-9.5条件下具有良好的稳定性;摇瓶优化结果表明:培养基初始p H 6.0、甲醇补加浓度1.0%、培养温度28°C、摇床转速250 r/min为最佳产酶条件,在此条件下发酵144 h胞外酶活达到42 U/m L(蛋白含量0.54 g/L);5 L发酵罐放大培养,发酵156 h(甲醇诱导96 h),木糖苷酶酶活为222.2 U/m L,蛋白含量2.36 g/L,较摇瓶提高了4.3倍。【结论】木糖苷酶在毕赤酵母中实现了高效表达,具有较好的工业化应用前景。
【作者单位】： 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室;南京林业大学江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室;河南天冠企业集团有限公司车用生物燃料技术国家重点实验室;南阳理工学院生物与化学工程学院;
【基金】：国家自然科学基金项目(No.21176106) 车用生物燃料技术国家重点实验室开放基金项目(No.KFKT2013010) 中国博士后科学基金项目(No.2015M571666) 江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室资助项目(No.JSBGFC14006) 河南省科技开放合作项目(No.162106000007)~~
【分类号】：Q78;Q55

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本文编号：2541254