家蚕体壁Spatzle5基因参与真菌与革兰氏阳性菌感染的Toll信号通路

发布时间：2019-09-26 16:45

【摘要】：昆虫是地球上种类最多的动物群体。与脊椎动物不同,昆虫没有获得性免疫,只能依靠自身的天然免疫抵御外界微生物的入侵。天然免疫是机体的第一道防线。微生物入侵时,一组种系编码的模式识别受体可以识别并结合到保守的病原体相关分子模式上,通过一系列的信号传导产生抗菌肽最终消灭微生物。Toll信号通路是目前研究最多的一条信号通路,昆虫Spatzle(spz)在Toll信号通路中发挥重要作用。本实验通过克隆家蚕Spatzle5(Bmspz5)基因、生物信息学分析、组织特异性表达、微生物诱导表达、RNA干扰等一系列实验来研究Bmspz5基因的特性和参与的Toll信号通路。具体的实验内容如下:本实验成功克隆出Bmspz5的ORF和3’非编码区,该基因位于7号染色体上,在基因组中只有1个拷贝,共有6个外显子,5个内含子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。该基因共编码405个氨基酸,通过序列比对发现其C末端比家蚕基因组数据库预测的ORF多出56个氨基酸。蛋白质分子质量为45.93 kD,等电点为8.96,为胞外蛋白,疏水区和亲水区域交错排列。生物信息学分析发现Bmspz5与果蝇和烟草天蛾的亲缘关系较近,并含有相同的七个保守的半胱氨酸结构域。半定量RT-PCR分析Bmspz5的组织表达情况,结果表明,Bmspz5基因在家蚕五龄三天幼虫各组织中的表达量都不相同,其中在头部中的表达量最高,在皮肤中的表达量相对较高,而在其他组织当中几乎都没有表达。微生物诱导实验结果表明,注射酵母菌和枯草芽孢杆菌能够引起Bmspz5基因在表皮中的表达量上调,而注射大肠杆菌则不能影响Bmspz5基因在表皮中的表达量,而在头中,注射酵母菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均不能引起Bmspz5基因的表达量上调。因此,我们可以推断Bmspz5基因参与了体壁中家蚕抵御真菌和革兰氏阳性菌入侵的免疫应答反应。RNA干扰实验表明,体壁中酵母菌感染后,Bmspz5基因的沉默能够明显抑制转录因子Cactus、Rel和抗菌肽Attain、Moricn和Gloverin的表达;注射芽孢杆菌时,也有类似的结果,但是抑制效率没有酵母菌的高。由此可见,Bmspz5基因沉默可以抑制抗菌肽Attain、Gloverin、Moricn和Toll通路中的转录因子Cactus、Rel的表达,而不能抑制IMD通路中转录因子Relish的表达。结果表明,Bmspz5基因参与家蚕体壁中Toll信号通路的免疫应答。
【图文】：

激活机制,果蝇,烟草天蛾

4图 1.1 果蝇 spz 的激活机制[27]Fig. 1.1 The activation mechanism of Drosophila spz[27]1.2.1.2 烟草天蛾的 spz 的研究进展烟草天蛾的 spz1 由于选择性剪接形成两个不同 cDNA，prospz1B 的前结构域插入10 个氨基酸残基，而 prospz1A 中则不存在。prospz1A cDNA 编码一个 32.7 kDa 的多肽，，与果蝇和家蚕 spz1 分别有 23％和 44％的同一性的。重组 prospz1A 是一个二硫键连接的同型二聚体[28]。烟草天蛾 prospz1A 的裂解激活需要丝氨酸蛋白酶的作用，已经在烟草天蛾的血淋巴中确定了超过 20 个的丝氨酸蛋白酶，但只有少数的功能已经知道。烟草天蛾血淋巴蛋白酶 6 和 8（HP6 和 HP8）各由一个氨基末端结构域和羧基末端蛋白酶域组成。HP6

序列,同源蛋白,系统发生树,物种

由 Rel1 介导的。spz1C 在脂肪体中组成型表达，而 spz1B 主要在雌蚊卵巢组织中。RNA 干扰敲除 spz1C 导致埃及伊文 Toll/ Rel1（NF-κB 转录因子果蝇 Dorsal 的物）通路的缺陷，表明埃及伊蚊 spz1C 的功能在脂肪体中介导真菌感染的免疫应]。在冈比亚按蚊中，六种果蝇 spz（spz1-6）的同源物在基因组中被鉴定[35]。目前已在多种生物中鉴定出 spz 基因，对不同物种的 spz 基因编码的蛋白序列进缘分析，结果发现家蚕、意蜂、印度跳蚁、丽蝇蛹集金小蜂、豌豆蚜、埃及伊蚊蝇、冈比亚按蚊、赤拟谷盗等昆虫的 spz 亲缘关系较近，而与哺乳动物的 spz 亲系相对较远(图 1.2)。对不同的昆虫的 spz 同源蛋白的氨基酸保守序列进行比对，赤拟谷盗、冈比亚安蚊、果蝇、烟草天蛾、埃及伊蚊、家蚕及豌豆长管蚜 spz 的酸序列有 7 个相同的半胱氨酸同源结构域。表明昆虫 spz 在进化上比较保守，可有相似的生物学功能，因此，为我们研究家蚕新的 spz 基因提供理论依据和研究。
【学位授予单位】：江苏科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S884

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