利用细胞特异性转基因小鼠和分子特异性抑制剂开展Metrnl和Nampt功能及机制研究

发布时间：2019-10-04 01:51

【摘要】：脂肪组织遍布于全身各处,长期以来一直被认为是机体储存能量的主要部位。除了储存多余能量,脂肪组织作为机体内高度活跃的内分泌器官,可分泌产生多种脂肪因子。这些脂肪因子可作用于局部脂肪组织,也可通过血液循环作用于其他组织器官。它们在生物体内的平衡与能量代谢、心脑血管功能、免疫炎症等过程密切相关。一旦这种平衡被打破,由此引发的代谢紊乱、免疫系统异常将会导致肥胖、动脉粥样硬化以及诸多心脑血管疾病的发生。因此,对脂肪因子的深入研究,对新脂肪因子的发现和功能阐明对疾病的诊断、治疗和预防都具有非常重大的意义。本课题利用细胞特异性转基因小鼠和分子特异性抑制剂研究脂肪因子Metrnl和Nampt在机体内的重要功能,并对机制进行了深入研究。本课题分为以下两个部分。第一部分为Metrnl调节胰岛素敏感性的机制研究。我们前期的研究结果表明,Metrnl是一种分泌蛋白,高表达于小鼠和人的皮下白色脂肪。在限食情况下,白色脂肪中Metrnl的表达会出现下调。而在高脂饮食(High fat diet,HFD)喂养的肥胖小鼠中,白色脂肪的Metrnl会出现显著升高。此外,Metrnl的表达在白色脂肪细胞分化过程中也会显著增加。一系列结果提示Metrnl作为一种脂肪因子,可能参与调节白色脂肪的生物学功能和能量代谢。我们前期利用基因工程手段制备了脂肪细胞特异性过表达Metrnl小鼠(Metrnl-Tg)以及脂肪细胞特异性敲除Metrnl小鼠(Metrnl-/-)。在这部分实验中,我们首先对Metrnl-/-小鼠的鉴定方法进行了改进和优化,建立了Metrnl细胞特异性敲除小鼠鉴定方法的标准操作流程。运用葡萄糖耐量实验(GTT),我们再次验证Metrnl-/-将会加重HFD引起的胰岛素抵抗,而脂肪细胞特异性过表达Metrnl可以对抗HFD或者瘦素缺乏引起的胰岛素抵抗。在胰岛素信号通路的研究中我们发现,Metrnl可显著提高白色脂肪胰岛素作用下AKT的磷酸化水平。为了进一步明确Metrnl增敏作用的机制,我们运用多种实验手段,对调节胰岛素敏感性的多种机制进行了探索。研究结果表明,Metrnl可抑制炎症因子的表达、改善脂质代谢、促进脂肪分化从而提高胰岛素敏感性。我们还检测到Metrnl在脂肪组织和成熟脂肪细胞中的分泌,并证实Metrnl可通过分泌的形式促进脂肪细胞的分化。使用PPARγ小分子化学抑制剂或者PPARγ干扰慢病毒可以阻断Metrnl的胰岛素增敏作用,证明了Metrnl可通过PPARγ参与机体胰岛素敏感性的调节。通过这一部分实验,我们阐明了Metrnl在白色脂肪中的重要功能。脂肪组织Metrnl可通过PPARγ信号通路促进脂肪细胞分化、改善代谢、抑制炎症从而调节脂肪功能,对抗肥胖引起的胰岛素抵抗,有望成为治疗代谢综合征和2型糖尿病的新靶点。第二部分为Nampt在限食调节氧化应激以及线粒体生物合成中的作用。限食也被称为饮食干预,是一种限制能量摄入的饮食调理手段。限食在延缓衰老、改善代谢、预防多种疾病发生发展过程中具有重要作用。SIRT家族是介导限食效应的关键分子,SIRT活性依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的生物合成。烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)是NAD+生物合成中的重要限速酶,我们前期的实验结果证明了Nampt参与限食介导的代谢功能改善作用。在这部分实验中,我们使用Nampt特异性化学抑制剂FK866全身性抑制Nampt酶活性,发现限食介导的SIRT3活性的增强、氧化应激水平的下降、抗氧化能力以及线粒体生物合成能力的增强都会被取消,证明了Nampt在限食调节氧化应激以及线粒体生物合成中的重要作用。
【图文】：

现较明显的条带，只是条带亮度略有差别（图 1，图 2）判断小鼠基因型，判断的结果极有可能出现假阴性或者因小鼠的培育工作造成很大的困扰。理论知识并结合实际操作经验，认为造成上述鉴定结果几个方面：①在小鼠剪尾过程中，由于使用的是同一把剪刀未完全擦拭干净，导致上一个鼠尾样本的残留组织样本中，造成不同个体间基因组有交叉污染。②不同鼠同，造成样本之间基因组 DNA 浓度不同，目的片段扩带亮度不同。③目的基因扩增使用的反应酶特异性不够性较强，扩增出与目的基因片段大小接近的非特异性片了相应调整并做了如下比较实验：①比较同一把剪刀会造成鉴定结果差异。②在 PCR 扩增体系中增设内参组 DNA 浓度差异造成的结果判断失误，亦可排除 DN结果。 ③比较常规普通基因组 PCR 扩增酶 Primix Taq HiFi PCR SuperMix 对 Cre 基因扩增特异性差异。我们条件进行了比较实验。比较实验结果如下：

图 2.不同剪刀剪尾，使用 Primix Taq PCR 扩增酶gure 2 Genotyping of Fabp4-Cre using different scissors and 图 3.同一把剪刀剪尾，，使用 TransTaq HiFi PCR SuperMFigure 3 Genotyping of Fabp4-Cre using a same scisTransTaq HiFi PCR SuperMix
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96

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本文编号：2545688