白蜡虫蜡酯合酶基因cDNA全长克隆及原核表达

发布时间：2019-10-04 02:09

【摘要】：白蜡虫Ericerus pela Chavannes是我国特有的资源昆虫,具有特化的泌蜡性状,其分泌的白蜡广泛用于机械、轻工、医药、食品等行业。蜡酯合酶(wax synthase,WS)是生物蜡酯合成途径中的关键酶之一,目前在昆虫中尚未鉴定出WS。本研究旨在获得白蜡虫蜡酯合酶基因cDNA全长,分析白蜡虫WS氨基酸序列,并在大肠杆菌中成功表达白蜡虫WS。实验结果为后续白蜡虫WS抗体制备、组织及亚细胞定位研究奠定基础,指导功能研究、酶活测定等后续实验的顺利完成,也为其它昆虫蜡酯合成研究提供了参考。详细结果如下:1.白蜡虫ws基因cDNA全长克隆及序列分析本实验根据前期实验获得的白蜡虫ws基因247bp的部分序列,采用Rapid Amplification of cDNA End(RACE)技术获得白蜡虫ws基因cDNA全长1518bp,ws基因开放阅读框1356bp,5’端非编码区94bp,3’端非编码区68bp。氨基酸序列预测结果显示,白蜡虫WS编码452个氨基酸,分子量为51.8kDa,理论等电点为6.35,脂溶系数为90.46,在N端具有一个分泌型信号肽,并且在N端存在一个包含22个氨基酸残基跨膜区域。根据WS氨基酸序列构建系统进化树,显示白蜡虫WS并未与已知其他物种WS聚为一支。研究结果显示白蜡虫WS的序列结构、跨膜方式、保守区域都与已知的其他物种WS都不相同,对白蜡虫WS的鉴定需要更多后续的研究。2.白蜡虫WS原核表达通过分析白蜡虫WS的序列结构,选取其中特异性较好、亲水性较高的一段多肽,在序列末端添加组氨酸标签,设计两端带有限制性酶切位点的引物,PCR扩增目的片段。构建原核表达载体pET-22b/EpelWS,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以28℃,1mM IPTG终浓度的条件分别诱导大肠杆菌大量表达目的蛋白。通过SDS-PAGE检测结果显示,IPTG诱导的大肠杆菌中出现目的条带。Western Blot检测结果显示,带有组氨酸标签的目的蛋白与小鼠抗6×His tag一抗、结合辣根过氧化物酶的二抗发生特异性结合,证实了白蜡虫WS在大肠杆菌中大量表达。
【图文】：

蜡酯,脱羰基,途径,酰基

芥中发现了新的蜡酯合成途径—脱羰基途径，区别于先途径会先将 C16 和 C18 脂酰辅酶 A 延伸为 C24 至 C34成脂肪醛、仲醇、酮及烷烃。这一途径多为植物角质层牛等植物中已鉴定出许多角质层蜡合成基因，角质层蜡脂肪醇酯化形成。但由于这一途径产生许多的中间产物带来了诸多不便，许多蜡酯合成相关基因的功能尚不清lypina et al., 2008; King et al., 2007; Kunst et al., 2003）。assica napus）中角质层蜡酯合成途径中编码合成烷烃的滑表皮性状的突变株，表皮中蜡酯含量大大减少。这也蜡酯合成途径属于脱羰基途径（Pu et al., 2013）。两种蜡

表达水平,小鼠,蜡酯,茎干

图 1-2 小鼠不同器官中 WS mRNA 的表达水平g.1-2 WS expression levels of mRNAin different organs of mouse（引自 Cheng et al., 20酯在植物中的功能主要包括作为储能物质及构成角质层。荷荷巴种子中蜡 97％，，在其种子胚乳中存在大量的 WS，蜡酯是种子萌发最主要的供abal et al., 2000）。Li 在对拟南芥茎干蜡酯合成途径关键酶 WS 的研究发现仅有 0.1％到 0.2％的蜡酯，茎干中也只有 0.7％到 2.9％。而在巴西rnicia cerifera）叶片蜡层中含有超过 85％的蜡酯（Kolattukudy, 1976），说物中的分布有很大差异。对拟南芥进行 WS 器官特异性模型的分析中，发表达水平最高，茎干、叶片次之，WS 在种子和根部仅有痕量表达，说明各物学功能的不同对 WS 分布有重要影响（Li et al., 2008）。通过 Northern B矮牵牛中 WS 在花瓣中表达水平最高，叶片次之（King et al., 2007）。
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S899.1

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