木薯eIF4E7基因RNAi载体构建及沉默效果分析

发布时间：2019-10-08 12:34

【摘要】：由木薯褐色条斑病毒(Cassava brown steak virus,CBSV)和乌干达木薯褐色条斑病毒(Uganda Cassava brown steak virus,UCBSV)引起的木薯褐色条斑病毒病(CBSD)严重威胁着非洲木薯种植业的发展,且目前没有十分有效的防治方法。病毒侵染植物需要借助植物的翻译和复制系统来完成基因组的翻译及自身的复制,其中真核翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,e IF4E)是多种RNA病毒侵染植物的必需因子。e IF4E7是木薯编码的e IF4E基因家族成员之一,本研究构建该靶标基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E7。本生烟瞬时表达系统结合半定量RT-PCR的方法证明,该载体能高效沉默过量表达载体p AI-Ca4E7中的e IF4E7基因在本生烟叶片中的表达。研究结果为进一步研究木薯e IF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用以及利用RNA技术干扰植物基因的病毒防治新策略奠定基础。
【图文】：

热带作物学报第38卷M：DL2000DNAMarker；1：目的基因eIF4E7PCR扩增；2：过量表达载体pAI-Ca4E7PCR鉴定；3：含载体pAI-Ca4E7的农杆菌EHA105PCR鉴定。M:DL2000DNAMarker;1:PCRamplificationofeIF4E7;2:PCRidentificationofover-expressionvectorpAI-Ca4E7;3:PCRidentificationofAgrobacteriaEHA105harboringover-expressionvectorpAI-Ca4E7.图3过量表达载体pAI-Ca4E7构建过程相关PCR扩增与鉴定结果Fig.3Partofagarosegelelectrophoresisdetectionintheprocessofconstructingover-expressionvectorpAI-Ca4E7M1231000750500250bpM：DL15000DNAMarker；1：载体p18TRNAi；2：中间载体pRNAiCa4E7R；3：中间载体pRNAiCa4E7；4：干扰载体p1300-Ca4E7。M:DL15000DNAMarker;1:p18TRNAi;2:pRNAiCa4E7R;3:pRNAiCa4E7;4:p1300-Ca4E7.图2干扰载体p1300-Ca4E7构建过程相关EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定Fig.2PlasmiddigestedwithrestrictionenzymeEcoRⅠandBamHⅠintheprocessofconstructingmediatingvectorp1300-Ca4E715001000500M1234bp2.4过量表达载体pAI-Ca4E7构建及农杆菌转化用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX对pAI-Ca4E7进行PCR鉴定，鉴定结果显示扩增条带（图3泳道2）与目的片段eIF4E7（图3泳道1）大小一致；用XbaⅠ和XhoⅠ对pAI-Ca4E7进行双酶切鉴定，切下的小片段与预期大小一致；由于插入基因ALSV内部有1个XbaⅠ位点，从载体pAI-ALSV切下2个小片段（图4泳道1与泳道2）。鉴定结果表明eIF4E7基因已插入到pAI表达载体，，命名为pAI-Ca4E7；经测序验证可知过量表达载体pAI-Ca4E7构建成功。采用液氮冷激法将pAI-Ca4E7转化至根癌农杆菌菌株LBA4404，用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX进行PCR鉴定，鉴定结果显示扩增条带（图3泳道3）与目的片段

ntificationofover-expressionvectorpAI-Ca4E7;3:PCRidentificationofAgrobacteriaEHA105harboringover-expressionvectorpAI-Ca4E7.图3过量表达载体pAI-Ca4E7构建过程相关PCR扩增与鉴定结果Fig.3Partofagarosegelelectrophoresisdetectionintheprocessofconstructingover-expressionvectorpAI-Ca4E7M1231000750500250bpM：DL15000DNAMarker；1：载体p18TRNAi；2：中间载体pRNAiCa4E7R；3：中间载体pRNAiCa4E7；4：干扰载体p1300-Ca4E7。M:DL15000DNAMarker;1:p18TRNAi;2:pRNAiCa4E7R;3:pRNAiCa4E7;4:p1300-Ca4E7.图2干扰载体p1300-Ca4E7构建过程相关EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定Fig.2PlasmiddigestedwithrestrictionenzymeEcoRⅠandBamHⅠintheprocessofconstructingmediatingvectorp1300-Ca4E715001000500M1234bp2.4过量表达载体pAI-Ca4E7构建及农杆菌转化用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX对pAI-Ca4E7进行PCR鉴定，鉴定结果显示扩增条带（图3泳道2）与目的片段eIF4E7（图3泳道1）大小一致；用XbaⅠ和XhoⅠ对pAI-Ca4E7进行双酶切鉴定，切下的小片段与预期大小一致；由于插入基因ALSV内部有1个XbaⅠ位点，从载体pAI-ALSV切下2个小片段（图4泳道1与泳道2）。鉴定结果表明eIF4E7基因已插入到pAI表达载体，命名为pAI-Ca4E7；经测序验证可知过量表达载体pAI-Ca4E7构建成功。采用液氮冷激法将pAI-Ca4E7转化至根癌农杆菌菌株LBA4404，用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX进行PCR鉴定，鉴定结果显示扩增条带（图3泳道3）与目的片段eIF4E7（图3泳道1）大小一致，说明pAI-Ca4E7已成功转入到农杆菌，形成了工程菌，可用于本生烟瞬时表达。2.5半定量RT-PCR检测沉默效果为检测RNAi载体的沉默效果，分别提取注射农杆菌后4dpi、5dpi和6dp
【作者单位】： 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
【基金】：国家自然科学基金项目资助(No.31461143016,No.31570145)
【分类号】：S435.33

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本文编号：2546297