猪FUT2基因沉默对其所在通路基因表达及小肠上皮细胞E.coliF18黏附能力的影响

发布时间：2019-10-08 05:27

【摘要】：旨在细胞水平上进一步探讨FUT2基因的功能及其在猪小肠上皮细胞受到F18大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)侵染时的调控机制,为提高仔猪对F18大肠杆菌病抵抗力的分子选育提供理论基础。运用Real-time PCR方法检测分析FUT2基因在大肠杆菌F18ab、F18ac感染和脂多糖(LPS)诱导小肠上皮细胞前后的mRNA表达差异,并采用Western blotting方法检测大肠杆菌F18ab、F18ac感染小肠上皮细胞前后FUT2的蛋白表达差异;同时设计并构建猪FUT2基因慢病毒干扰载体,筛选并获得FUT2基因稳定沉默的小肠上皮细胞系,检测FUT2基因沉默对其所在球系列鞘糖脂生物合成通路其他关键基因(FUT1、ST3GAL1、HEXA、HEXB、B3GALNT1、NAGA)表达以及小肠上皮细胞E.coli F18黏附能力的影响。结果表明,在F18大肠杆菌感染和LPS诱导小肠上皮细胞后,FUT2基因的mRNA相对表达水平均极显著升高(P0.01),同时大肠杆菌感染后小肠上皮细胞的FUT2蛋白表达上升。此外,本研究成功构建FUT2基因慢病毒干扰载体,并获得FUT2基因稳定沉默的小肠上皮细胞系;FUT2基因沉默后,其所在的球系列鞘糖脂生物合成通路其他关键基因的表达都存在不同程度的下降,其中FUT1基因表达水平显著下调(P0.05),ST3GAL1、HEXA和HEXB基因表达水平极显著下调(P0.01),而B3GALNT1和NAGA基因表达水平未发生显著变化,同时FUT2基因沉默后F18大肠杆菌对小肠上皮细胞的黏附能力显著降低。结果显示,FUT2基因低表达可能不利于仔猪大肠杆菌受体的形成,以增强猪小肠上皮细胞抵抗E.coli F18感染的能力,本试验结果同时为球系列鞘糖脂生物合成通路在仔猪抗大肠杆菌感染过程中的作用机制研究提供一定的理论基础和依据。
【图文】：

１）。下表同Ｂｌａｎｋｓｔａｎｄｓｆｏｒｔｈｅｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔａｎｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ；＊＊．Ｍｅａｎｓｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｒｅａｔ－ｍｅｎｔｓ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ图１ＦＵＴ２基因在大肠杆菌菌体感染细胞后的ｍＲＮＡ相对表达水平Ｆｉｇ．１ＴｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＦＵＴ２ｇｅｎｅｉｎｃｅｌｌｓｉｎ－ｆｅｃｔｅｄｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ图２０．１μｇ·ｍＬ－１ＬＰＳ诱导ＩＰＥＣ－Ｊ２后ＦＵＴ２基因的表达量Ｆｉｇ．２ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＵＴ２ｉｎＩＰＥＣ－Ｊ２ｉｎｄｕｃｅｄｂｙ０．１μｇ·ｍＬ－１ＬＰＳ２．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ分析大肠杆菌感染ＩＰＥＣ－Ｊ２后ＦＵＴ２蛋白的表达从图３可以看出，大肠杆菌Ｆ１８ａｂ和Ｆ１８ａｃ感染ＩＰＥＣ－Ｊ２后ＦＵＴ２蛋白表达水平高于对照组。这与ｍＲＮＡ相对定量的结果一致。２．４干扰载体构建与慢病毒液滴度测定通过对所挑取阳性克隆进行测序验证，最终获得连接正确的４个干扰和１个阴性对照慢病毒重组质粒载体，分别命名为ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－１、ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－２、ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－３、ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－４和ｐＧＬＶ３－ＦＵＴ２－ＮＣ。包装成功后收集病毒液进行病毒滴度检测和计算：４个干扰载体滴度均为３×１０８ＴＵ·ｍＬ－１，阴性对照为２×１０８ＴＵ·ｍＬ－１，该滴度水平达到了细胞感染的要求。用

ＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＵＴ２ａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙＲＮＡｉ表示ＦＵＴ２基因干扰，ＮＣ表示阴性对照。＊表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。下同ＲＮＡｉｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＦＵＴ２ｇｅｎｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，，ａｎｄＮＣｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．＊ｍｅａｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ图６ＦＵＴ２基因沉默后ＩＰＥＣ－Ｊ２细胞中各基因的表达Ｆｉｇ．６ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｉｎＩＰＥＣ－Ｊ２ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＦＵＴ２ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇＢｌａｎｋ表示空白对照Ｂｌａｎｋｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ图７ＦＵＴ２基因沉默的ＩＰＥＣ－Ｊ２细胞对大肠杆菌的黏附水平的荧光定量结果Ｆｉｇ．７ＴｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓａｂｏｕｔｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｏｆＩＰＥＣ－Ｊ２ｃｅｌｌｓｔｏＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｆｔｅｒｓｉｌｅｎｃｉｎｇＦＵＴ２ｇｅｎｅ２０４１
【作者单位】： 扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室;扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室;
【基金】：国家自然科学基金(31572360;31372285) 江苏省重点研发计划(现代农业)(BE2015329;BE2016315) 江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)
【分类号】：S858.28

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本文编号：2546129