虹鳟鱼IHNV甘肃分离株全基因图谱的绘制及灭活苗的研制

发布时间：2019-10-13 10:28

【摘要】：传染性造血器官坏死病病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae),诺拉弹状病毒属(Novirhabdovirus),是传染性造血器官坏死病(Infectious haematopoietic necrosis,IHN)的病原;该病毒所引起的IHN是以野生或人工养殖的少年鲑鱼造血组织和其他内脏器官的出血坏死为主要特征的急性、全身性、致死性的疾病;并且IHN是危害水产养殖鲑鱼类的一种非常重要的病毒性疾病,具有较强的致病性和高度传染性,该病依据鱼的种类和大小,毒株和环境因素的不同,致死率也有所不同,严重时可达100%,在世界范围内的水产养殖行业造成巨大的经济损失。我国甘肃省也是IHNV的流行之地;在甘肃省兰州市永登县某虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)养殖场采疑似IHNV的病鱼数条,做以下试验:(1)将所采病料进行IHNV的分离培养、RT-PCR鉴定、同源性和遗传进化分析。结果显示,病料经研磨过滤除菌的悬液接种鲤鱼上皮瘤细胞(Endothelial progenitor cell,EPC)出现典型的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),对该病毒的N基因进行特异性的扩增,扩增出了预期的1,408bp大小的片段;对扩增出的片段测序后进行同源性比较和系统进化树的分析,分离株与Ch2010008、HLJ-09、CJ-13、IHNV-PRT株的核苷酸同源性分别为99.7%、99.7%、99.2%和93.7%;分离株与Ch2010008、HLJ-09、CJ-13、IHNV-PRT株的氨基酸同源性分别为100%、100%、99.0%和89.3%;系统进化树分析显示,分离株与中国毒株Ch2010008、HLJ-09、CJ-13,韩国毒株IHNV-PRT在同一分支上,遗传关系较近。将分离的毒株暂时命名为GS1。结果表明造成虹鳟鱼死亡的病原是IHNV GS1。(2)为了进一步了解IHNV GS1的生物学特性、来源及传播路径,设计了10对特异性引物对该病毒全基因进行RT-PCR扩增,设计3条特异性引物进行该病毒3’端和5’端的快速扩增;并对IHNV GS1的6个结构蛋白分别进行氨基酸序列和核苷酸序列的同源性比对及系统进化树分析。结果显示:IHNV GS1序列全长为11,134bp;系统进化树分析得出,IHNV GS1的N、P和M基因与韩国毒株IHNV-PRT关系最近,G基因与韩国毒株RtGu01、RtUi02、ChYa07和日本毒株RtNag96的关系最近。结果表明,IHNV GS1属于JRt基因型,该毒株可能源于韩国或日本,该病毒可能是由于受IHNV污染的鱼卵、鱼苗及幼鱼的贸易所传播。(3)由于迄今为止,还没有任何一种疫苗被国际通用来预防IHNV,仅有加拿大本国的一种DNA疫苗获得了疫苗生产许可证,且仅在加拿大使用,所以本实验使用甲醛和β-丙内酯(β-propiolactone,BPL)两种灭活剂初步研制IHNV GS1灭活苗,通过对灭活苗物理性状的检验、病毒残余量的检测、无菌检验、安全性检验、保存期试验和效力试验等实验,得出灭活苗颜色为淡粉色或乳白色,用1 m L内径为1.2 mm的吸管,室温吸取1 mL的备用疫苗,垂直放置吸管,使两种灭活剂灭活的疫苗自然流出0.4 mL所用的时间均为0.4 s,吸取两种灭活剂灭活的备用疫苗,呈滴状滴入冷的蒸馏水表面,观察到两种疫苗均没有扩散,则判定为油包水剂型;两种灭活剂灭活的抗原接种鲤鱼上皮瘤细胞(EPC),盲传2次后,在倒置显微镜下观察,无细胞病变出现;灭活的抗原注射虹鳟鱼,没有虹鳟鱼死亡现象;灭活的抗原接种普通肉汤培养基、厌氧肉肝汤培养基、普通琼脂培养基及鲜血琼脂培养基,经过培养,均未出现培养基浑浊和培养板上有菌落出现等现象;两种灭活剂灭活的疫苗,接种虹鳟鱼观察30天后,接种疫苗的虹鳟鱼,无局部肿胀,无全身反应,均健康,疫苗判为合格;疫苗进行效力实验得出,两种灭活剂灭活的疫苗均有较好的防止感染IHNV的作用;初步研制的疫苗4℃保存12个月后接种虹鳟鱼,免疫鱼的成活率和效力试验的数据基本接近,所以保存期暂定为12个月。两种灭活剂灭活的疫苗对虹鳟鱼均有较好的保护性,这些研究结果为开发IHNV的灭活苗提供了研究基础。
【图文】：

病毒分离培养,图片

3.2 病毒的毒价测定将病毒按 10-1～10-10连续做 10 倍稀释接种于长满单层 EPC 细胞的 96 孔板中，培养 2 天后，根据 Karber 法计算出病毒的 TCID50为 10-7.5/0.1mL（如图 2-2）。图 2-1 病毒分离培养的图片A 为对照组图片；B 为接毒 3 天的图片；C 为接毒 4 天的图片；D 为接毒 6 天的图片Fig.2-1 Isolation and culture of virusA: control group; B: virus seeding for 3 day; C: virus seeding for 4 days; D: virus seedingfor 6 days.

实验组,目的,病毒感染,特异性引物

3.3 RT-PCR 检测结果病毒感染的细胞用 2.3.1 中所设的特异性引物进行 RT-PCR 扩增，，传染性血器官坏死病病毒(IHNV)扩增出了预期的特异性的目的条带，而病毒性出血败血症病毒(VHSV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)均未能扩增出相应的目的条（如图 2-3）。图 2-2 病毒滴度结果 A 为对照组，B-I 分别为 10-1-10-8的实验组Fig.2-2 Result of Viral titer test A: Control Group B-I: Test Group of 10-1-10-8
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S943

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