过表达FaSAMDC基因提高黑麦草属植物的抗旱性和耐热性

发布时间：2019-10-13 10:58

【摘要】：主要探讨了在黑麦草属植物中导入高羊茅S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(FaSAMDC)对转基因植株抗旱耐热性的提高效果,为培育黑麦草抗旱耐热新品种提供种质新材料。选择黑麦草成熟种子为外植体,采用贵州省草业研究所分子生物学实验室构建的过表达载体以及黑麦草胚性愈伤组织高频植株再生和农杆菌介导的遗传转化体系,将克隆自高羊茅的FaSAMDC基因转入贵州地区主栽品种多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季的基因组内,经抗性筛选、PCR检测和Southern杂交分析验证,获得45株特高与44株四季的转基因植株,转化频率分别为2.93%和2.28%。抗旱耐热试验表明,在30℃高温和中度干旱胁迫条件下,特高转基因株系的根冠比比对照组培苗高出7.08%,叶片相对含水量(RWC)比对照高出13.12%,RWC降低幅度比对照少5.49个百分点;四季转基因株系的根冠比比对照组培苗高出6.54%,RWC比对照高出12.54%,RWC降低幅度比对照少6.50个百分点,差异均达到显著水平(P0.05),证明转入FaSAMDC基因的黑麦草阳性株系的抗旱耐热能力得到了明显提高。形态与生长特征观测结果显示,与非转基因组培苗相比,转基因株系的叶长、株高、主茎节数减小,叶宽、单株分蘖数增加,叶色变深,植株形状趋向于叶片丛生的紧凑型,推测导入的FaSAMDC基因参与了基因表达、细胞分裂等生理功能的调节。
【图文】：

结构图,过表达,载体,结构图

的转基因植株。1材料与方法1．1材料黑麦草外植体选用在贵州地区种植较为普遍的品种的成熟种子，一年生黑麦草特高于2014年购于贵阳霖卉园林绿化有限公司，多年生黑麦草四季由贵州省草业研究所保存。2013至2014年构建的过表达载体是由经贵州省草业研究所分子生物学实验室改造过的植物表达载体pCAMBIA1300与克隆自高羊茅黔草1号的SAMDC基因(FaSAMDC)所形成的重组质粒pCAMBIA1300-FaSAMDC。该载体具有潮霉素(hygromycin，Hyg)和卡那霉素(kanamycin，Kan)抗性，在FaSAMDC片段的两侧各具有一个CaMV35S启动子，主要表达框架如图1所示。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105和GV3101中，经PCＲ和酶切验证获得阳性克隆［14］。图1构建的过表达载体结构图Fig．1SchematicicdiagramofconstructedrecombinantplasmidLB:左边界Leftborder;CaMVpoly(A):来自花椰菜花叶病毒35S启动子的多聚腺苷酸尾Polyadenylationfrom35Spromoterofcauliflowermosaicvirus;HYG:抗潮霉素序列Hygromycinresistantsequence;XhoI:限制性内切酶XhoI识别序列SequencerecognizedbyrestrictionenzymeXhoI;CaMV35Spromot-er1:来自花椰菜花叶病毒的35S启动子135Spromoter1fromcauliflowermosaicvirus;EcoＲI:限制性内切酶EcoＲI识别序列Sequencerecognizedbyre-strictionenzymeEcoＲI;NsiI:限制性内切酶NsiI识别序列SequencerecognizedbyrestrictionenzymeNsiI;SphI:限制性内切酶SphI识别序列Sequencerec-ognizedbyrestrictionenzymeSphI;PstI:限制性内切酶PstI识别序列SequencerecognizedbyrestrictionenzymePstI;FaSAMDC:插入的高羊茅腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因InsertedS-adenosylmethioninedecarboxylasegenefromFestucaarundinacea;

黑麦草,植株再生,遗传转化,抗性植株

中特高转基因株系比对照苗高出7．08%，四季转基因株系比对照高出6．54%，，差异均达到显著水平(P＜0．05)。图2农杆菌介导的黑麦草遗传转化及植株再生Fig．2Agrobacterium-mediatedtransformationofryegrassandregenerationofthetransformedplantletsA:诱导出的特高胚性愈伤组织;B:特高胚性愈伤组织与根癌农杆菌的共培养;C:四季抗性愈伤组织不定芽的分化;D:生根培养基中特高和四季抗性植株生根;E:特高和四季抗性植株移栽至花钵并成活;F:特高和四季抗性植株在人工气候室内生长。A:InducedembryogeniccallusofTetragold;B:Co-cultureofembryogeniccallusofTetragoldandAgrobacteriumtumefaciens;C:DifferentiationofadventitiousbudsfromresistantcallusofFourseasons;D:Hygromycin-resistantplantsofTetragoldandFourseasonsgrowinginrootingmedium;E:Hygromycin-resistantplantsofTetragoldandFourseasonspottedinsoilsuccessfully;F:Hygromycin-resistantplantsofTetragoldandFourseasonsgrowinginclimaticlaboratory．图3转基因黑麦草抗性植株潮霉素B基因的PCＲ检测Fig．3PCＲanalysisofBgeneofhygromycininputativetransgenicplantsofryegrassM:DNA分子量;+:EHA105-p1300菌(阳性对照);－:非转化植株(阴性对照);1～9:特高和四季转基因抗性植株。M:DNAmarker;+:StrainEHA105-p1300aspositivecontrol;－:Non-transformedplantasnegativecontrol;1－9:Transgenichygromycin-resistantplantsofTetragoldandFoursea-sons．表1农杆菌介导2个黑麦草品种的转化频率Table1TransgenicfrequencyoftworyegrasscultivarsbyAgrobacteriumtumefaciens特高Tetragold转化愈伤组织数No．ofcallitransformed抗性?
【作者单位】：贵州省农业科学院草业研究所;
【基金】：贵州省农业科技攻关项目(黔科合NY[2013]3060号) 贵州省农业科学院博士科研启动基金(2013-06) 黔农科院自主创新科研专项[(2014)010号] 贵州省高层次创新型人才培养项目(黔科合人才[2016]4024) 贵州省科技创新人才团队建设项目(黔科合平台人才[2016]5617)资助
【分类号】：S543.6

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