应用TALENs基因编辑技术创制抗PVY烟草种质的研究

发布时间：2019-10-22 09:05

【摘要】：烟草翻译起始因子家族成员eIF4E-6(Ntab0942120)与马铃薯Y病毒VPg互作决定着PVY对烟草的侵染进程,为打断PVY对烟草细胞的侵染途径,增强烟株自身对PVY的抗性,本研究应用TALENs技术,对烟草eIF4E-6基因进行了靶向修饰。1.eIF4E-6基因TALENs表达载体的构建综合eIF4E-6与烟草eIF4E家族成员序列比对和TALEN Targeter在线软件设计TALENs靶序列,进行TALEN模块组装构建TALENs表达载体,利用Luciferase SSA报告载体法进行TALENs活性评价,获得体外DNA剪切活性较为理想的两个TALENs表达载体T3和T4,构建TALEN敲除载体并用电击法导入LBA4404感受态细胞制备工程菌。2.转化烟草采用根癌农杆菌介导的叶盘法,转化易感PVY的烟草品种K326,并对转化苗进行潮霉素B抗性基因的PCR检测,分别获得了T3和T4 TALENs表达载体的T0代阳性转化烟株40和50株。3.eIF4E-6基因突变位点的检测阳性转化子DNA进行eIF4E-6基因的PCR扩增,扩增产物连入T载体克隆测序,经序列比对,T0代群体中,表达载体T3获得靶位点大片段碱基缺失突变型1株、靶位点碱基替换突变型3株。表达载体T4获得靶位点碱基替换突变型5株。4.突变材料的抗性分析接种PVY后突变材料症状较野生对照有所减轻,Real Time RT-PCR检测结果表明突变株的eIF4E-6基因表达量与病毒量均低于非转基因K326烟株。5.突变材料的生理生化分析接种PVY后,烟株体内酶活性检测结果发现各突变型T0代烟株的PAL、POD和SOD活性与野生型K326烟株相比有不同程度的升高。
【图文】：

图 1-2 PVY 病毒 VPg 与寄主 eIF4E 的互作模型Fig.1-2 The interaction of VPg from PVY and eIF4E of host 与 PVY 抗病相关性寄主植物细胞的侵染和增殖需要依赖寄主代谢系统提供提供病毒致病必备的条件，阻碍病毒的侵染，寄主植物从抗病植物种质中定位了多种抗病毒基因，已经发现来r21，pvr22 和 pvr6[18,20]，来源于拟南芥的 Ispl[21]和来源豌豆种传花叶病毒（PSbMV）抗性基因 sbml，sbm2 等[编码 eIF4E 和 eIF(iso)4E。RNA 与 elF4E 结合是通过 5′ 帽子结构，但 PVY 基因组构，现已证实共价结合 VPg 蛋白充当了其替代物。酵

EN 基因定点改造技术LEN 的结构与原理s 是由黄单胞杆菌分泌的一种蛋白，该蛋白由 N 端、DNA 结构域及 C 端 4 个部分组成（见图 1-3a）。研究发现：不同的NA 结合域含有数个氨基酸组成高度保守的重复单元，每个基酸组成，其中只有第 12、13 位氨基酸可以改变，称作双Repeat variable di-residue，RVD）[31]。Moscou[32]和 Boch[33]等基识别规律，，为 TALEN 技术的发展奠定了基础。Mahfouz[34]和床黄杆菌的一种限制性内切酶 FokI 替换了 TALEs 蛋白 一次得到效率较高的人工核酸酶 TALEN（见图 1-3b），可用目前 TALENs 系统已日益成熟。
【学位授予单位】：牡丹江师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2

【参考文献】

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本文编号：2551569