石磺科贝类MSTN和MyHC基因的克隆和表达分析

发布时间：2019-10-24 14:17

【摘要】：石磺科贝类是在海水、淡水、陆地都有分布的一类生物,它们的生活区域分布于浅海、滩涂潮间带甚至潮上带,生活环境具有典型的两栖性,其皮肤呼吸能力的强弱、肌肉的结构、角质层的形成和神经系统的发育程度因生活环境的不同表现出明显的生物适应性,因此石磺科贝类又被认为是海洋无脊椎动物从水生到陆生进化的过渡类群。为探究肌肉在石磺由海洋向陆地进化过程中发挥作用的分子机制,探讨其在该过程中产生的适应性进化,本论文以我国分布广泛且研究较为深入的4种石磺作为实验对象,以已有的转录组数据库为基础,比较分析后筛选、克隆了石磺肌肉相关基因,分析在不同种石磺、各组织中的表达状态,并对4种石磺进化关系进行了初步探讨。(1)采用RACE方法从瘤背石磺(Onchidium struma)肌肉中首次克隆到MSTN cDNA的全长并做了相应的组织表达分析。研究结果表明瘤背石磺MSTN基因cDNA全长2667bp,5′-非翻译区(5′-UTC)的长度为374bp,3′端非翻译区(3′-UTC)的长度为643bp,1650bp的开放阅读框(ORF),对应编码549个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质原子总量为8776,分子式为C2774H4331N783O862S26,分子质量约为63.27kD,理论等电点为6.02,信号肽预测结果显示MSTN蛋白N端具有21个氨基酸长度的信号肽。瘤背石磺MSTN具有MSTN的共同特征,包括蛋白酶水解位点RSRR和C端多肽生物活性区以及9个保守的半胱氨酸残基。系统发生树分析结果显示瘤背石磺MSTN与加州海兔MSTN的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MSTN基因在各个组织中均有表达;含肌纤维组织中的表达量低于内脏器官的表达量,在瘤背石磺肝胰腺中的表达量最高,瘤背石磺腹足中表达量最低(P0.05)。(2)以石磺科4种贝类转录组数据为基础,瘤背石磺(Onchidium struma)、里氏拟石磺(Paraoncidium reevesii)、平疣桑椹石磺(Platevindex mortoni)、紫色疣石磺(Peronia verruculata)为实验材料克隆了4种石磺的MyHC基因的编码区全长并进行了分析,结果表明瘤背石磺MyHC基因cDNA全长7566bp,开放阅读框为5895bp,对应编码1964个氨基酸,同时包括228bp的5’端非翻译区,1443bp的3’端非翻译区。预测瘤背石磺MyHC基因编码的蛋白质由31713个原子组成,分子式为C9765H15897N2849O3150S52,相对分子量约为225.28kD,理论等电点为5.56,信号肽预测结果表明瘤背石磺MyHC蛋白N端具有29个氨基酸长度的信号肽。瘤背石磺MyHC具有两个保守结构域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l,且亲水性氨基酸集中在Myosin_tail_l。里氏拟石磺MyHC的cDNA全长7598bp,包括5904bp的开放阅读框,对应编码1967个氨基酸,276bp的5′端非翻译区,1418bp的3′端非翻译区,预测编码蛋白原子总量31713,分子式为C9765H15894N2860O3156S56;平疣桑椹石磺MyHC的cDNA全长7115bp,预测开放阅读框为5904bp,预测编码1967个氨基酸,5′-UTC为165bp,3′-UTC为1046bp,预测编码蛋白原子总量31776,分子式为C9785H15921N2865O3153S52;紫色疣石磺MyHC的cDNA全长7115bp,预测ORF为5904bp,对应编码1967个氨基酸,192bp的5′-UTC,1059bp的3′-UTC,预测编码蛋白原子总量31730,分子式为C9762H15895N2859O3157S57。石磺科贝类MyHC具有两个保守结构域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l,且亲水性氨基酸集中在Myosin_tail_l。该实验结果对深入研究石磺肌球蛋白重链基因的原位杂交实验、western blot检测奠定了基础。(3)为探究石磺科贝类肌肉相关基因在各组织中的表达差异,分别取瘤背石磺的背部皮肤、腹部皮肤、腹足、肺囊、肝胰腺、口球、两性腺、蛋白腺8个组织以及里氏拟石磺、平疣桑椹石磺、紫色疣石磺的背部皮肤、腹部皮肤、腹足、肺囊4个组织进行荧光定量检测。MyHC基因在4种石磺不同组织中的荧光定量结果显示:背部皮肤中,瘤背石磺的表达量最高,里氏拟石磺表达量最低,且表达差异显著;腹部皮肤中,平疣桑椹石磺表达量最高;腹足中平疣桑椹石磺表达量最高,瘤背石磺次之,里氏拟石磺表达量最低,表现出显著差异;肺囊中整体表达量低,瘤背石磺表达量最高,未出现显著性差异。瘤背石磺MSTN、MyHC基因在瘤背石磺8个组织中均检测到表达,且大致上呈现一种负相关的关系,从而间接证明MSTN基因对MyHC的表达具有一定的负调控作用。实验结果为今后研究石磺科贝类肌肉生长发育及其调节机理打下了基础,对进一步研究石磺科肌肉相关基因进行原核表达及多克隆抗体的制备具有参考意义,更为深入探讨海洋无脊椎动物从水生向陆生适应性进化的研究提供了分子依据。
【图文】：

氨基酸序列,背石,氨基酸序列,序列

图 2-1 瘤背石磺 MSTN cDNA 序列和推测的氨基酸序列下划线表示信号肽序列，双下划线表示 TGF-β 结构域，波浪线表示 AATAAA加尾信号和 Poly(A)尾巴。方框内表示蛋白酶水解位点，阴影部分为保守的半胱氨酸残基Fig. 2-1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of O.struma MSTNThe UTR and ORF regions are shown in lowercase and uppercase letters, respectively;underline is thededuced signal peptide;TGF-beta domain is double underlined;The putative eukaryotic polyadenylationsignal(AATAAA) and polyadenylation signal is shown in wavy line; The proteolytic processing site(RKKR) is boxed;the shadow is The conserved cysteine residues (Cys).

氨基酸序列,背石,三级结构

图 2-2 预测的瘤背石磺 MSTN 三级结构Fig. 2-2 MSTN in O.struma tertiary structure predicte析背石磺 MSTN 的进化地位，使用 MrBayes-3.2.6 和 MEGA6.0 构的 19 个物种 22 条 MSTN 序列的系统进化树（前者为 MrBayesA6.0 数据）。进化树结果显示，无脊椎动物和脊椎动物分为两支的 MSTN 聚类成一个分支，然后与光滑双脐螺聚在一起，栉孔聚在一起，，随后这两个分支又与美洲地蟹（Gecarcinus laterali鱼的 MSTN 聚在一起，人（Homo sapiens）和黑猩猩（Pan tro一个独立的分支（图 2.3）。将瘤背石磺 MSTN 氨基酸序列与其氨基酸序列进行多重比对，发现在 TGF-β 结构域各个物种氨基表 2.2 其他物种 MSTN的 NCBI登录号
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

【参考文献】