瘤胃中干酪乳杆菌的亚油酸异构酶基因的克隆与表达

发布时间：2019-10-25 14:36

【摘要】：以从黄牛瘤胃中分离到的一株具有将亚油酸转化为c9,t11-共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Fx为出发菌株,提取其基因组DNA,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增得到1 700 bp大小的亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase,LAI)基因片段,将该基因片段纯化后进行TA克隆,得到重组质粒p UCm-T-LAI,将重组质粒p UCm-T-LAI和表达质粒p ET-Dsb A同时进行双酶切,连接得到重组表达载体p ET-Dsb A-LAI,经PCR鉴定和酶切后,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中,得到具有LAI活性的重组菌株,能将亚油酸转化为c9,t11-CLA,表明从Lactobacillus casei Fx成功克隆LAI,该研究将有助于深入了解不同瘤胃细菌特异性合成不同CLA异构体的LAI基因差异。
【图文】：

uscaseiFx中与c9,t11-CLA合成相关的LAI基因，以提取得到的该菌基因组为模板，进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，得到一条大小约为1700bp的条带，经测序并与GenBank（CP002391.1）的序列进行比对，两者基因的同源性为98.0%，其编码的氨基酸序列的同源性达到99.5%，由此可见LactobacilluscaseiFx中的LAI基因与文献相一致。2.2LAI基因的克隆及鉴定将纯化后的LAI基因与pUCm-T（2773bp）载体进行连接反应，提取pUCm-T-LAI克隆质粒进行双酶切分析及PCR鉴定，进一步判断插入的片段是否为目的条带，结果如图2所示。泳道2得到约1700bp和2700bp左右的2个片段，与插入的LAI基因片段和质粒pUCm-T大小一致。以提取的克隆质粒为模板，进行PCR扩增，泳道1出现一条约为1700bp的条带，与LAI基因相符。由此进一步证明重组质粒是pUCm-T载体和LAI基因重组后的阳性克隆子。4000bpM122000bp1000bpM.DNAMarker；1.PCR结果；2.双酶切结果。图2克隆质粒的PCR鉴定及酶切鉴定Fig.2PCRidentificationoftherecombinantclonedplasmidafterenzymaticdigestion2.3LAI基因重组表达载体的构建及鉴定4000bp2000bp1000bpM12M.DNAMarker；1.双酶切结果；2.PCR结果。图3重组表达载体的PCR鉴定及酶切鉴定Fig.3PCRidentificationoftherecombinantexpressionvectorafterenzymaticdigestion将pUCm-T-LAI克隆质粒和pET-DsbA表达载体进行双酶切，经连接反应，得到重组表达载体pET-DsbA-LAI，对其进行PCR鉴定及酶切鉴定，结果如图3所示。用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切后，泳道1出现2个条带，，大小分别约为3600bp和1700bp，分别符合pET-DsbA表达载体（3600bp）和LAI基因大校以提取的重组表达载体为模板，特异性PCR扩增LAI基因，泳道2得到?

bp左右的2个片段，与插入的LAI基因片段和质粒pUCm-T大小一致。以提取的克隆质粒为模板，进行PCR扩增，泳道1出现一条约为1700bp的条带，与LAI基因相符。由此进一步证明重组质粒是pUCm-T载体和LAI基因重组后的阳性克隆子。4000bpM122000bp1000bpM.DNAMarker；1.PCR结果；2.双酶切结果。图2克隆质粒的PCR鉴定及酶切鉴定Fig.2PCRidentificationoftherecombinantclonedplasmidafterenzymaticdigestion2.3LAI基因重组表达载体的构建及鉴定4000bp2000bp1000bpM12M.DNAMarker；1.双酶切结果；2.PCR结果。图3重组表达载体的PCR鉴定及酶切鉴定Fig.3PCRidentificationoftherecombinantexpressionvectorafterenzymaticdigestion将pUCm-T-LAI克隆质粒和pET-DsbA表达载体进行双酶切，经连接反应，得到重组表达载体pET-DsbA-LAI，对其进行PCR鉴定及酶切鉴定，结果如图3所示。用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切后，泳道1出现2个条带，大小分别约为3600bp和1700bp，分别符合pET-DsbA表达载体（3600bp）和LAI基因大校以提取的重组表达载体为模板，特异性PCR扩增LAI基因，泳道2得到大小约为1700bp的单一条带，与LAI基因大小相符，说明得到的重组表达载体正确插入了目的条带。表明本研究不仅成功构建了pET-DsbA-LAI的重组载体，而且成功将其转化到DH5α中。
【作者单位】： 南昌大学中德联合研究院食品科学与技术国家重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金地区科学基金项目(31260373) 江西省重点研发计划项目(20161BBF60094)
【分类号】：Q93;Q78

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本文编号：2552826