应用多重PCR技术快速筛查食品中的转基因成分

发布时间：2019-10-25 19:17

【摘要】：以转基因植物中常见的3种筛选调控元件、2种标记基因和1种目的基因为检测靶标,建立了能在一次PCR扩增中同时检测6种转基因成分的多重PCR检测方法。结果表明,当多重PCR体系中Ca MV35S启动子、Fa MV35S启动子、NOS终止子、bar基因、NPTII基因、CP4-EPSPS基因的检测引物浓度分别为0.2、0.2、0.3、0.3、0.2、0.2μmol/L,退火温度为60℃时扩增效果最佳,利用优化后的六重PCR方法可从转基因玉米、大豆、棉花、油菜等各类样品中精准检测出相应的转基因成分,方法的检测灵敏度可达到0.1%。该方法为食品中常见转基因成分的筛查提供了一种高效的手段,在转基因产品的检测工作中具有较高的应用价值。
【图文】：

电泳图谱,引物,特异性,多重PCR

15985、LLCOTTON25、转基因油菜GT73、非转基因植物混合物等13种植物样品。结果显示，利用设计的FMV35S启动子引物能够从阳性对照样品、MON89034玉米、MON89788大豆、MON1445棉花和GT73油菜样品中扩增出401bp的特异性片段，利用NPTII基因引物则能从阳性对照样品、MON863玉米、MON531棉花、MON1445棉花和MON15985棉花样品中获得499bp的特异性扩增产物，均与预期结果一致（见图1和表1）。由此确定了6个检测靶标的扩增引物，不同扩增产物之间至少相差60bp，从理论上确保多重PCR产物可通过3%的琼脂糖凝胶电泳进行区分。图1FMV35S启动子和NPTII基因检测引物的特异性测试Fig.1SpecificityoftheprimersforFMV35SpromoterandNPTIIgene为进一步验证筛选出的6对检测引物（表2）在单一PCR和多重PCR中的适用性，以非转基因植物混合物的DNA样品为稀释剂，将阳性对照样品DNA溶液稀释至每个转化体组分质量分数均为1%，进行单一PCR和多重PCR测试。结果如图2所示，以6对引物分别进行单一PCR扩增时，均能从阳性对照样品中特异性地扩增出对应的转基因成分，而将6对引物放在同一PCR管中进行六重PCR扩增时，可从阳性对照样品中扩增到6种预期的转基因成分，且在电泳图谱中能够清晰识别出每一种检测靶标的特异性条带，表明这6对引物适用于构建多重PCR检测体系。图2引物适用性测试Fig.2ApplicabilityoftheprimersforsingletandmultiplexPCRassays2.2六重PCR的扩增体系和反应程序优化由于每种转基因成分检测引物的扩增效率和退火温度不尽相同，为保证每对引物在多重PCR体系中均能正常工作，尽可能降低引物间的交互抑制，并确保建立的多重PCR方法满足一定的检测灵敏度，需对每种检测靶标的引物用量和退火温度进行梯度测试[12]。为此，将阳性对

电泳图谱,适用性,引物

获得499bp的特异性扩增产物，均与预期结果一致（见图1和表1）。由此确定了6个检测靶标的扩增引物，不同扩增产物之间至少相差60bp，从理论上确保多重PCR产物可通过3%的琼脂糖凝胶电泳进行区分。图1FMV35S启动子和NPTII基因检测引物的特异性测试Fig.1SpecificityoftheprimersforFMV35SpromoterandNPTIIgene为进一步验证筛选出的6对检测引物（表2）在单一PCR和多重PCR中的适用性，以非转基因植物混合物的DNA样品为稀释剂，将阳性对照样品DNA溶液稀释至每个转化体组分质量分数均为1%，进行单一PCR和多重PCR测试。结果如图2所示，以6对引物分别进行单一PCR扩增时，，均能从阳性对照样品中特异性地扩增出对应的转基因成分，而将6对引物放在同一PCR管中进行六重PCR扩增时，可从阳性对照样品中扩增到6种预期的转基因成分，且在电泳图谱中能够清晰识别出每一种检测靶标的特异性条带，表明这6对引物适用于构建多重PCR检测体系。图2引物适用性测试Fig.2ApplicabilityoftheprimersforsingletandmultiplexPCRassays2.2六重PCR的扩增体系和反应程序优化由于每种转基因成分检测引物的扩增效率和退火温度不尽相同，为保证每对引物在多重PCR体系中均能正常工作，尽可能降低引物间的交互抑制，并确保建立的多重PCR方法满足一定的检测灵敏度，需对每种检测靶标的引物用量和退火温度进行梯度测试[12]。为此，将阳性对照样品DNA用非转基因植物混合物的DNA稀释成每个转化体组分分别为质量分数1%和0.1%的测试样品，设置CaMV35S启动子、FMV35S启动子、NOS终止子、bar基因、NPTII基因、CP4-EPSPS基因的引物终浓度比为0.2∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2、0.2∶0.2∶0.25∶0.25∶0.2∶0.2、0.2∶0.2∶0.3∶0.3∶0.2∶0.2等3种组合，退火温度为58、6
【作者单位】：吉林省农业科学院;
【基金】：国家转基因生物新品种培育重大专项课题(2014ZX08012-001) 吉林省农业科技创新工程项目(2013-2016)
【分类号】：TS207.3

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