日本蛇根草查尔酮合酶基因的克隆及其生物信息学分析

发布时间：2019-10-30 01:13

【摘要】：查尔酮合酶(CHS)是类黄酮生物合成过程中的第一个关键酶,其在类黄酮的合成过程中发挥着非常重要的作用。本研究以日本蛇根草为研究材料,根据其转录组测序结果设计全长引物,通过RT-PCR方法成功克隆得到日本蛇根草查尔酮合酶基因完整的cDNA序列,并利用相关生物信息学软件对其进行分析。结果表明,该基因序列全长为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测其蛋白分子量为42.783 kD,等电点为6.05,是亲水性蛋白质,不含有信号肽,很可能定位在细胞质中。同时,二级结构分析显示,日本蛇根草CHS的二级结构分别由180个α螺旋、84个延伸链、125个无规则卷曲组成,这与三维结构预测结果相一致。日本蛇根草CHS基因的克隆对于研究植物类黄酮的生物合成及其分子机制具有重要意义,同时也丰富了双子叶植物PKS基因家族的相关研究。
【图文】：

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蛇根草类黄酮代谢的研究仍处于空白阶段。本研究以日本蛇根草为材料，利用分子生物学方法克隆得到其类黄酮合成的关键酶基因-CHS基因，并对其进行了生物信息学分析。该项工作将为未来研究茜草目植物CHS基因功能、及类黄酮代谢的分子机制研究奠定基础，同时对改良茜草目植物的类黄酮代谢研究具有重要指导意义。1结果与分析1.1CHS基因的克隆及其编码蛋白质理化性质分析以日本蛇根草的cDNA为模板，利用全长引物CHSF1，CHSR1进行PCR扩增。扩增得到的片段包含完整的CDS序列，长1170bp，编码389个氨基酸(图1)。随后，利用ExPasy软件对日本蛇根草查尔酮合酶的氨基酸序列进行理化性质预测。结果显示，CHS理论等电点为6.05，分子量为42.783kD，CHS基因的蛋白质分子式为C1909H3058N512O564S18，蛋白质的半衰期为30h，不稳定指数是40.68，为不稳定蛋白。CHS有49个负电荷氨基酸残疾(Asp+Glu)，44个正电荷氨基酸残疾(Arg+Lys)。其脂肪系数为93.24，平均疏水性为-0.094，表明该蛋白是一个亲水蛋白质。图1日本蛇根草CHS基因的cDNA序列Figure1cDNAsequenceofOphiorrhizajaponicaCHSgene1260

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定位的概率均低于细胞质，分别是细胞核中21.7%、线粒体上13%、液泡中4.3%(表2)。因此，日本蛇根草的CHS蛋白定位在细胞质中的可能性最大。1.5日本蛇根草CHS疏水性及编码蛋白二级结构预测根据日本蛇根草CHS的氨基酸序列，利用Ex-Pasy软件在线预测其疏水曲线，该蛋白的最高值为2.42，在第342个氨基酸处，，疏水性最强；最低值为-2.489，在第119个氨基酸处，亲水性最强(图4)。同时，从整条肽链的氨基酸预测值来看，其中大部分为负值，没有明显的疏水区域。由此可以推断，日本蛇根草的CHS蛋白是一种亲水性蛋白。图2不同植物CHS蛋白氨基酸的系统进化树分析Figure2PhylogenetictreeanalysisofCHSaminoacidsequenceindifferentplants移的短肽链，长度为5~30个氨基酸不等。它指导蛋白质的跨膜转移，保证新合成的蛋白质能够准确进行定位运输。通过SignalP4.1Server在线软件对日本蛇根草CHS所编码的蛋白质进行信号肽预测(表1)。当相应氨基酸残基的平均信号肽得分值大于0.5时，被认定存在信号肽；小于0.5时则不存在信号肽。而日本蛇根草查尔酮合成酶基因所编码蛋白质的氨基酸残基平均信号肽最大得分值为0.101，因此该蛋白不存在信号肽(图3)。表1日本蛇根草CHS蛋白信号肽预测Table1SignalP-NNpredictionforOphiorrhizajaponicaCHSprotein指标IndexMax.CMax.YMax.SMeanS位点Site301211-46分值Scores0.1100.1220.1590.101注:C-score:原始剪切位点的分值;S-score:信号肽的分值;Y-score:综合剪切位点的分值Note:C-score:Scoresofputativecleavagesite;S-score:Scoresofsignalpeptide;Y-score:Scoresofsynthesiscleavagesite表2日本蛇根草CHS的亚细胞定位Table2SubcellularlocationofOph
【作者单位】：贵州师范大学生命科学学院植物生理与发育调控重点实验室;贵阳中医学院药学院;
【基金】：贵州师范大学资助博士科研项目(0516006) 贵州省联合基金项目(黔科合LH字[2015]7777号) 贵州省重点实验室建设项目(黔科合计Z字[2011]4005)共同资助
【分类号】：Q943.2;S567.239

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