农杆菌介导‘蜂蜜罐’枣上胚轴和子叶遗传转化体系的建立及Bt基因的转化

发布时间：2019-10-30 04:21

【摘要】：枣树是我国重要的经济树种之一,具有抗旱、耐瘠薄、适应性强等特点,并且枣树果实营养丰富,深受大众喜爱。枣树杂交育种由于工作量大、育种周期长,极大地限制了枣树的栽培发展,与此同时,枣尺蠖、枣粘虫、枣桃小食心虫、黄刺蛾等常见害虫也极大地制约了枣树的生产栽培。枣树虫害研究的需求,随着枣树种植面积的一步步扩大,枣树虫害一步步地蔓延和加重,也在慢慢地扩大和延伸。现代分子生物技术,尤其是植物组织培养和基因工程的发展,为枣树定向改良和新品种选育提供了重要的技术支持;而转基因技术的出现为快速培育枣树抗虫新种质提供了可能。本试验以‘蜂蜜罐’枣胚培苗上胚轴和子叶为试验材料,进行根癌农杆菌介导的遗传转化,通过比较不同处理的GUS瞬时表达率,研究了不同的预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度和侵染方式对转化效率的影响,优化了农杆菌介导上胚轴和子叶的遗传转化体系;在此基础上,以‘蜂蜜罐’枣上胚轴、子叶和叶片为外植体,利用农杆菌介导法进行Bt基因的转化研究,为遗传转化培育抗虫新种质奠定了基础。主要研究结果如下:1.不同外植体Kan敏感性试验以上胚轴和子叶为外植体,探究了不同浓度Kan对愈伤组织形成和不定芽再生的影响。结果表明,50 mg/L Kan为抑制上胚轴和子叶再生的最适浓度。2.上胚轴和子叶遗传转化体系的建立通过比较GUS瞬时表达率,确定了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度和侵染方式的最适处理。结果表明,以上胚轴为外植体时,菌液浓度OD600为0.5,采用真空辅助侵染10 min,共培养培养基添加20 mg/L乙酰丁香酮,共培养3 d后GUS瞬时表达率最高,为最佳转化体系;以子叶为外植体,预培养3 d,菌液浓度OD600为0.5,采用真空辅助侵染10 min,共培养培养基添加10 mg/L乙酰丁香酮,共培养3 d后GUS瞬时表达率最高,为最佳遗传转化体系。3.农杆菌介导‘蜂蜜罐’枣不同外植体Bt基因的转化分别以上胚轴、子叶和叶片为外植体,通过农杆菌介导Bt基因遗传转化,对三种外植体获得的抗性芽进行PCR检测,共获得21株经PCR检测为阳性的植株,并对三种外植体的转化率进行了比较。
【图文】：

上胚轴,褐化,愈伤,外植体

不同浓度 Kan 的上胚轴再生状况如图 3 所示。在添加 75 mg/L 和 100 mg/L Kan 的处理中，上胚轴切口无愈伤产生，并且部分外植体都已褐化（图 D、图 E）；而在添加 0 mg/L 和图 3 上胚轴不同浓度 Kan 的再生A：0 mg/L；B：25 mg/L；C：50 mg/L；D：75 mg/L；E：100 mg/L.Figure 3:Regeneration of epicotyls under different concentration of KanA: 0 mg/L; B: 25 mg/L; C: 50 mg/L; D: 75 mg/L; E: 100 mg/L.A B C D E

子叶,愈伤组织形成,切口,部分子

不同浓度 Kan 的子叶再生状况如图 4 所示。仅当添加 25 mg/L Kan 时，少部分子叶切口处有少量愈伤组织产生，，当添加的 Kan 浓度大于 25 mg/L 时，所有子叶均无愈伤组织形成，并且子叶切口褐化；当不添加 Kan 时，所有子叶均有愈伤组织形成，同时部分子叶切口再生不定芽。综合愈伤组织形成率和外植体再生状况确定子叶筛选培养基中添加的 Kan 浓度为 50 mg/L。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S665.1

【相似文献】